Sv Ansikte Endokardiell kuddeberedning för planär morfogenesanalys i musembryon
Summary
Klassiskt har endokardiet hos musens embryonala ventilprimordium analyserats med hjälp av transversala, koronala eller sagittala sektioner. Vårt nya tillvägagångssätt för en ansikte, tvådimensionell avbildning av endokardiet vid valvulogena regioner möjliggör plan polaritet och cellomläggningsanalys av endokardiet under ventilutveckling.
Abstract
Studien av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för utvecklingen av däggdjurshjärtat är avgörande för att ta itu med mänsklig medfödd hjärtsjukdom. Utvecklingen av de primitiva hjärtklaffarna involverar epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) av endokardiella celler från de atrioventrikulära kanalerna (AVC) och utflödeskanalen (OFT) i hjärtat som svar på lokala induktiva myokardiella och endokardiella signaler. När cellerna delaminerar och invaderar den extracellulära matrisen (hjärtgelé) som ligger mellan endokardiet och myokardiet bildas de primitiva endokardiella kuddarna (EC). Denna process innebär att endokardiet måste fylla luckorna som lämnas av de delaminerade cellerna och måste omorganisera sig för att konvergera (smala) eller förlänga (förlänga) längs en axel. Aktuell forskning har involverat den plana cellpolaritetsvägen (PCP) för att reglera den subcellulära lokaliseringen av de faktorer som är involverade i denna process. Klassiskt har de inledande faserna av hjärtklaffsutveckling studerats i tvärsnitt av embryonala hjärtan eller in ex vivo AVC eller OFT explanter odlade på kollagengeler. Dessa tillvägagångssätt möjliggör analys av apico-basal polaritet men tillåter inte analys av cellbeteende inom epitelets plan eller av de morfologiska förändringarna hos migrerande celler. Här visar vi ett experimentellt tillvägagångssätt som möjliggör visualisering av endokardiet vid valvulogena regioner som ett planfält av celler. Detta experimentella tillvägagångssätt ger möjlighet att studera PCP, plan topologi och intercellulär kommunikation inom endokardiet hos OFT och AVC under ventilutveckling. Dechiffrera nya cellulära mekanismer som är involverade i hjärtklaffmorfogenes kan bidra till att förstå medfödd hjärtsjukdom i samband med endokardiella kudddefekter.
Introduction
Hjärtat är det första funktionella organet i ett däggdjursembryo. Runt embryonal dag (E) 7,5 hos möss bildar bilaterala precardiac mesodermceller hjärtmånen i ventralsidan1. Hjärtmånen innehåller två populationer av prekardiella celler som inkluderar föregångare till myokardiet och endokardiet2. Runt E8.0 smälter hjärtprekursorerna samman i mittlinjen och bildar det primitiva hjärtröret som består av två epitelvävnader, det yttre myokardiet och det inre endokardiet, som är ett specialiserat endotel åtskilt av en extracellulär matris som heter hjärtgelé. Senare, vid E8.5, genomgår hjärtröret högerslinga. Det loopade hjärtat har olika anatomiska regioner med specifika molekylära signaturer såsom utflödeskanalen (OFT), ventriklarna och atrio-ventrikulärkanalen (AVC)3. Även om hjärtröret initialt expanderar vid sin inflödessida genom tillsats av celler4, vid E9.5, resulterar intensiv hjärtproliferation i ballongbildning av kamrarna och etablering av det trabekulära nätverket5. Ventilbildning sker i AVC (framtida mitral- och tricuspidventiler) och i OFT (framtida aorta- och lungventiler).
Endokardiet spelar avgörande roller i ventilutvecklingen. Endokardiella celler genomgår epitel-mesenkymal övergång (EMT) i AVC och OFT för att bilda endokardiella kuddar, en struktur som uppträder vid början av ventilutvecklingen. Olika signalvägar aktiverar denna process; vid E9.5 hos möss främjar NOTCH aktiverat i endokardiet som svar på myokardiell härledd BMP2 invasiv EMT av endokardiella celler i AVC- och OFT-regionerna genom aktivering av TGFβ2 och SNAIL (SNAI1), som direkt undertrycker uttrycket av vaskulär endotelkadherin (VE-cadherin), en transmembrankomponent i adherenskorsningar (AJs)6,7,8 . I OFT förmedlas aktivering av endokardiet för att initiera EMT av FGF8 och BMP4, vars uttryck aktiveras av NOTCH 9,10,11,12.
Progression av EMT involverar cellulär dynamik när celler ändrar form, bryter och gör om korsningar med sina grannar, delaminerar och börjar migrera13. Dessa förändringar inkluderar AJ-ombyggnad och gradvis demontering av 14,15, planar cellpolaritet (PCP) -signalering, förlust av apico-basal polaritet (ABP), apikal förträngning och cytoskelettorganisation 16,17. ABP avser fördelningen av proteiner längs den främre-bakre axeln hos en cell. I det utvecklande hjärtat krävs ABP-reglering i kardiomyocyter för ventrikulär utveckling18. PCP avser en polariserad fördelning av proteiner i celler över planet för en vävnad och reglerar cellulär distribution; Epitel med en stabil geometri består av hexagonformade celler, där endast tre celler konvergerar vid hörnen 19,20,21,22. Olika cellulära processer, såsom celldelning, grannutbyte eller delaminering som inträffar under epitelmorfogenes, ger en ökning av antalet celler som konvergerar på ett hörn och antalet angränsande celler som en given cell har22. Dessa cellulära beteenden relaterade till PCP kan regleras av olika signalvägar, aktindynamik eller intracellulär handel23.
De data som genereras för att studera ventilutveckling hos möss har erhållits från transversala, koronala eller sagittala sektioner av E8.5 och E9.5 embryonala hjärtan, där endokardiet visas som en linje av celler istället för som ett fält av celler – endokardiet täcker hela innerytan av hjärtröret24. Embryonala sektioner tillåter inte analys av PCP i endokardiet hos musembryon. Vår nya experimentella metod möjliggör analys av endokardiell cellfördelning, AJ-anisotropi och encellsformanalys, vilket visas i de representativa resultaten. Denna typ av data krävs för PCP-analys, tillsammans med beskrivningen av andra molekyler relaterade till PCP, som inte visas i denna rapport. Helmonterad immunofluorescens, specifik provberedning och användning av genetiskt modifierade möss möjliggör planär polaritetsanalys i endokardiet vid början av ventilutveckling hos möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endokardiet är ett epitelmonolager som täcker hela den inre ytan av det embryonala hjärtröret. Under ventilutveckling genomgår endokardiella celler vid de potentiella klaffregionerna EMT, så endokardiella celler transformerar och omorganiserar deras cytoskelett för att delaminera från endokardiet mot hjärtgelén. Vi och andra har fått relevanta data om ventilutveckling i musembryon genom att analysera tvärgående sektioner av E8.5 och E9.5 embryonala hjärtan, där endokardiet visas som en rad celler<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidragen PID2019-104776RB-I00 och CB16/11/00399 (CIBER CV) från MCIN/AEI/10.13039/501100011033 till J. L. P. J.G.-B. finansierades av Programa de Atracción de Talento från Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. finansierades av Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi tackar CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, medfinansierad av MCIN/AEI /10.13039/501100011033 och FEDER “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi tackar också A. Galicien och L. Méndez för mushållning. Kostnaden för denna publikation stöddes delvis av medel från Europeiska regionala utvecklingsfonden. CNIC stöds av ISCIII, MCIN och Pro CNIC Foundation och är ett Severo Ochoa Center of Excellence (bidrag CEX2020-001041-S) finansierat av MCIN/AEI /10.13039/501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
