Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Summary

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Abstract

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. Aspectos críticos de doenças metastáticas, como o complexo microambiente neural e a interação de células estromais, não podem ser inteiramente replicados com ensaios in vitro ; assim, os modelos animais são fundamentais para investigar e compreender os efeitos da intervenção terapêutica. No entanto, a maioria dos métodos de xenoenxertia de tumores cerebrais não produz metástases cerebrais consistentemente em termos de período de tempo e carga tumoral. Modelos de metástases cerebrais gerados pela injeção intracardíaca de células cancerígenas podem resultar em carga tumoral extracraniana não intencional e levar à morbidade e mortalidade metastática não cerebral. Embora a injeção intracraniana de células cancerígenas possa limitar a formação de tumores extracranianos, ela tem várias ressalvas, como as células injetadas frequentemente formam uma massa tumoral singular no local da injeção, alto envolvimento leptomeníngeo e danos à vasculatura cerebral durante a penetração da agulha. Este protocolo descreve um modelo de rato de metástase cerebral gerada pela injeção da artéria carótida interna. Este método produz tumores intracranianos de forma consistente sem o envolvimento de outros órgãos, possibilitando a avaliação de agentes terapêuticos para metástases cerebrais.

Introduction

A metástase cerebral é uma neoplasia maligna prevalente associada a um prognóstico muito ruim ^1,2. O padrão de atendimento para pacientes com metástases cerebrais é multimodal, consistindo em neurocirurgia, radioterapia de todo o cérebro e/ou radiocirurgia estereotáxica, dependendo do estado geral de saúde dos pacientes, da carga de doença extracraniana e do número e localização de tumores no cérebro ^3,4. Pacientes com até três lesões intracranianas são elegíveis para ressecção cirúrgica ou radiocirurgia estereotáxica, enquanto a radioterapia de todo o cérebro é recomendada para pacientes com lesões múltiplas para evitar o risco de infecção e edema relacionados à cirurgia⁵. No entanto, a radioterapia de todo o cérebro pode infligir danos às estruturas cerebrais radiossensíveis, contribuindo para a má qualidade de vida⁶.

A terapia sistêmica é uma alternativa não invasiva e uma abordagem lógica para o tratamento de pacientes com lesões múltiplas⁷. No entanto, é menos considerado devido à noção de longa data de que as terapias sistêmicas têm baixa eficácia, pois a entrega passiva de drogas citotóxicas através da corrente sanguínea não pode atingir níveis terapêuticos no cérebro sem o risco de toxicidade insegura⁸. Esse paradigma está começando a mudar com a terapia sistêmica recentemente aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA (tucatinibe com trastuzumabe e capecitabina, indicada para metástase cerebral metastática com câncer de mama HER2+)9,10,11,12 e a atualização nas diretrizes de tratamento para incluir a consideração de opções de terapia sistêmica para pacientes com metástase cerebral ^13,14.

Nesse contexto, os desenvolvimentos no campo da terapia molecular direcionada, imunoterapia e sistemas alternativos de liberação de medicamentos, como um portador de nanofármacos direcionado, podem potencialmente superar os desafios do tratamento de metástases cerebrais^15,16,17,18. Além disso, abordagens químicas e mecânicas para melhorar a administração de fármacos via permeabilização da barreira crânio-tumoral também estão sendo investigadas^19,20. Para estudar e otimizar tais abordagens para serem adequadas ao propósito, é crucial usar modelos pré-clínicos que não apenas espelhem a complexa fisiologia da metástase cerebral, mas também permitam a análise objetiva da resposta intracraniana a medicamentos.

Em termos gerais, as abordagens atuais para modelar metástases cerebrais in vivo envolvem injeção intracardíaca (ventrículo esquerdo), intravenosa (geralmente veia da cauda), intracraniana ou intracarótida (artéria carótida comum) de células cancerígenas em camundongos 21,22,23,24,25,26,27 . Além das estratégias de enxerto tumoral, modelos de camundongos geneticamente modificados em que a formação de tumores é desencadeada pela remoção de genes supressores de tumor ou ativação de oncogenes são úteis para a modelagem tumoral. No entanto, apenas alguns modelos de camundongos geneticamente modificados são relatados para produzir tumores secundários e ainda menos que produzem de forma confiável metástases cerebrais^28,29,30.

Métodos de enxerto como injeção intracardíaca (ventrículo esquerdo) e intravenosa (geralmente veia da cauda) imitam a disseminação sistêmica do câncer. Esses modelos normalmente produzem lesões em múltiplos órgãos (por exemplo, cérebro, pulmões, fígado, rins, baço), dependendo do leito capilar que retém a maioria das células tumorais durante sua “primeira passagem” ^{circulatória31}. No entanto, taxas inconsistentes de enxerto cerebral exigirão mais animais para atingir o tamanho da amostra para o poder estatístico desejado. O número de células tumorais que eventualmente se estabelecem no cérebro através desses métodos de injeção intracardíaca e intravenosa é variável. Assim, a carga tumoral de metástase cerebral pode variar entre os animais e a diferença na progressão pode tornar a padronização da linha do tempo experimental e a interpretação dos resultados um desafio. A carga tumoral extracraniana pode levar à mortalidade por metástases não cerebrais, tornando esses modelos inadequados para avaliar a eficácia intracraniana. Linhagens celulares cérebro-trópicas têm sido estabelecidas usando processos de seleção clonal artificial para reduzir o estabelecimento extracraniano, mas as taxas de tomada têm sido inconsistentes, e o processo de seleção clonal pode reduzir a heterogeneidade normalmente encontrada em tumores humanos³².

Métodos de enxerto específicos do cérebro, como a injeção intracraniana e intracarótida, permitem uma modelagem de metástases cerebrais mais consistente e eficiente. No método intracraniano³³, as células cancerosas são tipicamente injetadas no córtex cerebral frontal, o que gera crescimento tumoral rápido e reprodutível com baixo envolvimento sistêmico. Embora o procedimento seja bem tolerado com baixa mortalidade³³, as ressalvas são de que é uma abordagem relativamente grosseira que introduz rapidamente um bolo (localizado) de células no cérebro e não modela a patogênese precoce da metástase cerebral. A agulha danifica a vasculatura do tecido cerebral, o que causa inflamação localizada ^5,34. Por experiência, há uma tendência de células tumorais injetadas para refluxo durante a remoção da agulha, levando ao envolvimento leptomeníngeo. Alternativamente, o método intracarotídeo entrega células na artéria carótida comum com microvasculatura cerebral como o primeiro leito capilar a ser encontrado, modelando a sobrevivência na circulação, extravasamento e colonização²⁴. Concordando com outros²⁵, nossa experiência com esse método constatou que ele pode resultar em tumores faciais devido à entrega não intencional de células cancerígenas através da artéria carótida externa para leitos capilares nesses tecidos (dados não publicados). É possível prevenir tumores faciais ligando primeiro a artéria carótida externa antes da injeção da artéria carótida comum (Figura 1). No resto do artigo, este método é referido como a “injeção interna da artéria carótida”. A partir da experiência, o método de injeção da artéria carótida interna gera consistentemente metástases cerebrais com muito poucos eventos sistêmicos e tem sido bem-sucedido na geração de modelos de metástases cerebrais de diferentes cânceres primários (por exemplo, melanoma, mama e câncer de pulmão) (Figura 1). As desvantagens são que é tecnicamente desafiador, demorado, invasivo e requer otimização cuidadosa do número de células e um cronograma de monitoramento. Em resumo, os métodos de injeção intracraniana e interna da artéria carótida produzem modelos de camundongos adequados para avaliar o impacto terapêutico no benefício de sobrevida relacionado ao tumor cerebral.

Este protocolo descreve o método de injeção da artéria carótida interna para produzir um modelo de metástase cerebral em camundongo com quase nenhum envolvimento sistêmico e, portanto, adequado para avaliação pré-clínica da distribuição de medicamentos e eficácia da terapêutica experimental.

Figura 1: Representação esquemática do protocolo de injeção da artéria carótida interna para metástase cerebral. A injeção interna da artéria carótida com ligadura externa da artéria carótida pode produzir de forma confiável um modelo de metástase cerebral de vários cânceres primários. Neste protocolo, três ligaduras são colocadas na artéria carótida (anotadas como L1-L3 na figura). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os estudos foram conduzidos dentro das diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (UQCCR/186/19) e do Código Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos. 1. Preparação de células cancerosas para injeção NOTA: Neste estudo, a linhagem celular de câncer de mama humano, BT-474 (BT474), foi usada. O BT474 foi cultivado em meio de crescimento completo composto por meio RPMI 1640 suplementado com…

Representative Results

Comparando a injeção da artéria carótida comum com ou sem ligadura externa da artéria carótidaQuando as células cancerosas foram injetadas através da artéria carótida comum sem primeiro ligar a artéria carótida externa24, tumores faciais foram encontrados em 77,8% dos camundongos enxertados (n = 7/9 animais). Um exemplo de tumor facial é ilustrado na Figura Suplementar 3. O método descrito neste protocolo previne metástases fac…

Discussion

A metástase cerebral é um processo complexo de células cancerosas que se espalham de seu local primário para o cérebro. Diferentes modelos animais estão disponíveis que espelham certos estágios desse processo de várias etapas e há considerações fisiológicas e práticas para o desenho de estudos pré-clínicos de metástases^41,42. A maioria dos estudos publicados que investigam o uso da nanomedicina para o tratamento de metástases cerebrais utilizou …

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010