Моделирование метастазирования в мозг путем инъекции раковых клеток во внутреннюю сонную артерию

Summary

Метастазы в мозг являются причиной тяжелой заболеваемости и смертности у онкологических больных. Большинство моделей метастазирования в мозг у мышей осложняются системными метастазами, смешивающими анализ смертности и результатов терапевтического вмешательства. Здесь представлен протокол внутренней каротидной инъекции раковых клеток, который продуцирует последовательные внутричерепные опухоли с минимальными системными опухолями.

Abstract

Метастазы в мозг являются причиной тяжелой заболеваемости и смертности у онкологических больных. Критические аспекты метастатических заболеваний, такие как сложное нервное микроокружение и взаимодействие стромальных клеток, не могут быть полностью воспроизведены с помощью анализов in vitro ; таким образом, животные модели имеют решающее значение для исследования и понимания эффектов терапевтического вмешательства. Тем не менее, большинство методов ксенотрансплантации опухолей головного мозга не производят метастазы в мозг последовательно с точки зрения временных рамок и опухолевой нагрузки. Модели метастазирования в мозг, генерируемые внутрисердечной инъекцией раковых клеток, могут привести к непреднамеренной экстракраниальной опухолевой нагрузке и привести к метастатической заболеваемости и смертности вне мозга. Хотя внутричерепная инъекция раковых клеток может ограничить образование экстракраниальной опухоли, она имеет несколько предостережений, таких как введенные клетки часто образуют единичную опухолевую массу в месте инъекции, высокое поражение лептоменингеала и повреждение сосудистой системы мозга во время проникновения иглы. Этот протокол описывает мышиную модель метастазирования в мозг, генерируемого инъекцией внутренней сонной артерии. Этот метод последовательно продуцирует внутричерепные опухоли без участия других органов, что позволяет оценить терапевтические агенты для метастазирования в мозг.

Introduction

Метастазирование в мозг является распространенным злокачественным новообразованием, связанным с очень плохим прогнозом ^1,2. Стандартом лечения пациентов с метастазами в мозг является мультимодальный подход, состоящий из нейрохирургии, лучевой терапии всего мозга и / или стереотаксической радиохирургии в зависимости от общего состояния здоровья пациентов, бремени экстракраниальных заболеваний, а также количества и расположения опухолей в головном ^{мозге 3,4}. Пациенты с тремя внутричерепными поражениями имеют право на хирургическую резекцию или стереотаксическую радиохирургию, в то время как лучевая терапия всего мозга рекомендуется для пациентов с множественными поражениями, чтобы избежать риска инфекции, связанной с хирургическим вмешательством, и отека⁵. Однако лучевая терапия всего мозга может нанести ущерб радиочувствительным структурам мозга, способствуя низкому качеству жизни⁶.

Системная терапия является неинвазивным альтернативным и логическим подходом к лечению пациентов с множественными поражениями⁷. Тем не менее, это менее рассматривается из-за давнего представления о том, что системная терапия имеет низкую эффективность, потому что пассивная доставка цитотоксических препаратов через кровоток не может достичь терапевтических уровней в мозге без риска небезопасной токсичности⁸. Эта парадигма начинает меняться с недавно одобренной Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) системной терапией (тукатиниб с трастузумабом и капецитабином, показанным для метастатического метастазирования рака молочной железы HER2 + в мозг)9,10,11,12 и обновлением руководящих принципов лечения, чтобы включить рассмотрение вариантов системной терапии для пациентов с метастазами в мозг^13,14.

В этом контексте разработки в области молекулярной таргетной терапии, иммунотерапии и альтернативных систем доставки лекарств, таких как целевой нанопрепарат, могут потенциально преодолеть проблемы лечения метастазов в мозг 15,16,17,18. Кроме того, химические и механические подходы к улучшению доставки лекарств путем пермеабилизации барьера опухоли головного мозга также исследуются^19,20. Чтобы изучить и оптимизировать такие подходы, чтобы они соответствовали цели, крайне важно использовать доклинические модели, которые не только отражают сложную физиологию метастазирования в мозг, но и позволяют объективно анализировать внутричерепную реакцию на лекарства.

В целом, современные подходы к моделированию метастазирования в мозг in vivo включают внутрисердечную (левый желудочек), внутривенную (обычно хвостовую вену), внутричерепную или внутрикаротидную (общая сонная артерия) инъекцию раковых клеток у мышей 21,22,23,24,25,26,27 . Помимо стратегий приживления опухоли, генетически модифицированные мышиные модели, где образование опухоли запускается удалением генов-супрессоров опухолей или активацией онкогенов, полезны для моделирования опухолей. Тем не менее, только несколько генетически модифицированных моделей мышей, как сообщается, производят вторичные опухоли и еще меньше, которые надежно производят метастазы в мозг 28,29,30.

Методы приживления, такие как внутрисердечная (левый желудочек) и внутривенная (обычно хвостовая вена) инъекции, имитируют системную диссеминацию рака. Эти модели обычно вызывают поражения в нескольких органах (например, мозге, легких, печени, почках, селезенке) в зависимости от капиллярного русла, которое захватывает большинство опухолевых клеток во время их циркуляторного «первого прохода»³¹. Однако непоследовательные темпы приживления мозга потребуют большего количества животных для достижения размера выборки для желаемой статистической мощности. Количество опухолевых клеток, которые в конечном итоге устанавливаются в мозге с помощью этих внутрисердечных и внутривенных методов инъекций, варьируется. Следовательно, метастазна в мозг опухолевая нагрузка может варьироваться между животными, и разница в прогрессировании может сделать стандартизацию экспериментальной временной шкалы и интерпретацию результатов проблемой. Экстракраниальная опухолевая нагрузка может привести к смертности от метастазов вне мозга, что делает эти модели непригодными для оценки внутричерепной эффективности. Линии клеток мозг-тропики были установлены с использованием искусственных процессов клонального отбора для уменьшения экстракраниального учреждения, но показатели приема были непоследовательными, и процесс клонального отбора может уменьшить гетерогенность, обычно встречающуюся в опухолях человека³².

Специфические для мозга методы приживления, такие как внутричерепная и внутрикаротидная инъекция, позволяют более последовательно и эффективно моделировать метастазы в мозг. В внутричерепном методе³³ раковые клетки обычно вводят в лобную кору головного мозга, которая генерирует быстрый и воспроизводимый рост опухоли с низким системным участием. Хотя процедура хорошо переносится с низкой смертностью³³, предостережения заключаются в том, что это относительно грубый подход, который быстро вводит (локализованный) болюс клеток в мозг и не моделирует патогенез ранних метастазов в мозг. Игла повреждает сосудистую ткань мозга, что затем вызывает локализованное воспаление ^5,34. По опыту, существует тенденция к инъекции опухолевых клеток к рефлюксу во время удаления иглы, что приводит к лептоменингеальному вовлечению. Альтернативно, внутрикаротидный метод доставляет клетки в общую сонную артерию с микроциркуляторным руслом мозга в качестве первого капиллярного русла, с которым можно столкнуться, моделируя выживание в циркуляции, экстравазацию и колонизацию²⁴. В соответствии с другими²⁵, наш опыт работы с этим методом показал, что он может привести к опухолям лица из-за непреднамеренной доставки раковых клеток через наружную сонную артерию в капиллярные ложа в этих тканях (неопубликованные данные). Предотвратить опухоли лица можно, предварительно перевязав наружную сонную артерию перед инъекцией общей сонной артерии (рисунок 1). В остальной части статьи этот метод упоминается как «инъекция внутренней сонной артерии». Исходя из опыта, метод инъекции внутренней сонной артерии последовательно генерирует метастазы в мозг с очень небольшим количеством системных событий и был успешным в создании моделей метастазирования в мозг различных первичных видов рака (например, меланомы, рака молочной железы и легких) (рисунок 1). Недостатки заключаются в том, что это технически сложно, трудоемко, инвазивно и требует тщательной оптимизации количества клеток и графика мониторинга. Таким образом, как внутричерепные, так и внутренние методы инъекций сонной артерии создают мышиные модели, подходящие для оценки терапевтического воздействия на выживаемость, связанную с опухолью головного мозга.

Этот протокол описывает метод инъекции внутренней сонной артерии для получения мышиной модели метастазирования в мозг почти без системного участия и, следовательно, подходит для доклинической оценки распределения лекарств и эффективности экспериментальных терапевтических средств.

Рисунок 1: Схематическое изображение протокола инъекции внутренней сонной артерии для метастазирования в мозг. Инъекция внутренней сонной артерии с перевязкой наружной сонной артерии может надежно производить модель метастазирования в мозг от различных первичных видов рака. В этом протоколе три лигатуры помещаются на сонную артерию (на рисунке аннотируется как L1-L3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Все исследования проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Квинсленда (UQCCR/186/19) и Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях. 1. Подготовка раковых клеток к инъекциям <p class="…

Representative Results

Сравнение общей инъекции сонной артерии с перевязкой наружной сонной артерии или без нееКогда раковые клетки вводили через общую сонную артерию без предварительного перевязки наружной сонной артерии24, опухоли лица были обнаружены у 77,8% трансплантированн…

Discussion

Метастазирование в мозг представляет собой сложный процесс распространения раковых клеток от их первичного участка к мозгу. Доступны различные модели на животных, которые отражают определенные этапы этого многоступенчатого процесса, и существуют физиологические и практические сооб…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010