Modellering av hjärnmetastaser genom inre halspulsåderinjektion av cancerceller

Summary

Hjärnmetastaser är en orsak till svår sjuklighet och dödlighet hos cancerpatienter. De flesta hjärnmetastaseringsmusmodeller kompliceras av systemiska metastaser som förvirrar analys av dödlighet och terapeutiska interventionsresultat. Här presenteras ett protokoll för intern karotisinjektion av cancerceller som producerar konsekventa intrakraniella tumörer med minimala systemiska tumörer.

Abstract

Hjärnmetastaser är en orsak till svår sjuklighet och dödlighet hos cancerpatienter. Kritiska aspekter av metastatiska sjukdomar, såsom den komplexa neurala mikromiljön och stromacellinteraktionen, kan inte helt replikeras med in vitro-analyser ; Således är djurmodeller avgörande för att undersöka och förstå effekterna av terapeutisk intervention. De flesta hjärntumörxenografteringsmetoder producerar dock inte hjärnmetastaser konsekvent när det gäller tidsramen och tumörbördan. Hjärnmetastaseringsmodeller som genereras av intrakardiell injektion av cancerceller kan resultera i oavsiktlig extrakraniell tumörbörda och leda till icke-hjärnmetastatisk sjuklighet och dödlighet. Även om intrakraniell injektion av cancerceller kan begränsa extrakraniell tumörbildning, har den flera försiktighetsåtgärder, såsom de injicerade cellerna bildar ofta en singulär tumörmassa vid injektionsstället, hög leptomeningeal involvering och skador på hjärnvaskulatur under nålpenetration. Detta protokoll beskriver en musmodell av hjärnmetastaser som genereras av intern halspulsåderinjektion. Denna metod producerar intrakraniella tumörer konsekvent utan inblandning av andra organ, vilket möjliggör utvärdering av terapeutiska medel för hjärnmetastaser.

Introduction

Hjärnmetastaser är en utbredd malignitet i samband med en mycket dålig prognos ^1,2. Vårdstandarden för hjärnmetastaseringspatienter är multimodal och består av neurokirurgi, strålbehandling i hela hjärnan och/eller stereotaktisk radiokirurgi beroende på patienternas allmänna hälsotillstånd, extrakraniell sjukdomsbörda och antalet och placeringen av tumörer i hjärnan ^3,4. Patienter med upp till tre intrakraniella lesioner är berättigade till kirurgisk resektion eller stereotaktisk radiokirurgi, medan strålbehandling i hela hjärnan rekommenderas för patienter med flera lesioner för att undvika risken för kirurgirelaterad infektion och ödem⁵. Strålbehandling av hela hjärnan kan dock orsaka skador på radiokänsliga hjärnstrukturer, vilket bidrar till dålig livskvalitet⁶.

Systemisk terapi är ett icke-invasivt alternativt och logiskt tillvägagångssätt för att behandla patienter med flera lesioner⁷. Det är dock mindre övervägt på grund av den långvariga uppfattningen att systemiska terapier har dålig effekt eftersom passiv leverans av cytotoxiska läkemedel via blodomloppet inte kan uppnå terapeutiska nivåer i hjärnan utan risk för osäker toxicitet⁸. Detta paradigm börjar förändras med den nyligen godkända systemiska behandlingen av U.S. Food and Drug Administration (FDA) (tucatinib med trastuzumab och capecitabin indicerat för metastaserande HER2+ bröstcancerhjärnmetastaser)9,10,11,12 och uppdateringen av behandlingsriktlinjerna för att inkludera övervägande av systemiska terapialternativ för hjärnmetastaseringspatienter^13,14.

I detta sammanhang kan utvecklingen inom molekylär riktad terapi, immunterapi och alternativa läkemedelsleveranssystem, såsom en riktad nano-läkemedelsbärare, potentiellt övervinna utmaningarna med hjärnmetastasbehandling^15,16,17,18. Dessutom undersöks kemiska och mekaniska metoder för att förbättra läkemedelsleverans via permeabilisering av hjärntumörbarriären^19,20. För att studera och optimera sådana tillvägagångssätt för att vara lämpliga för ändamålet är det viktigt att använda prekliniska modeller som inte bara speglar den komplexa fysiologin för hjärnmetastaser utan också möjliggör objektiv analys av intrakraniellt läkemedelssvar.

I stort sett involverar de nuvarande metoderna för modellhjärnmetastaser in vivo intrakardiell (vänster ventrikel), intravenös (vanligtvis svansven), intrakraniell eller intrakarotis (vanlig halspulsåder) injektion av cancerceller hos möss 21,22,23,24,25,26,27 . Förutom tumörengraftmentstrategier är genetiskt modifierade musmodeller där tumörbildning utlöses genom avlägsnande av tumörsuppressorgener eller aktivering av onkogener användbara för tumörmodellering. Men endast ett fåtal genetiskt modifierade musmodeller rapporteras producera sekundära tumörer och ännu färre som på ett tillförlitligt sätt producerar hjärnmetastaser^28,29,30.

Engraftmentmetoder som intrakardiell (vänster ventrikel) och intravenös (vanligtvis svansven) injektion efterliknar den systemiska spridningen av cancer. Dessa modeller producerar vanligtvis lesioner i flera organ (t.ex. hjärna, lungor, lever, njurar, mjälte) beroende på kapillärbädden som fångar de flesta tumörceller under deras cirkulationspass “första pass”³¹. Inkonsekventa nivåer av hjärningraftment kommer dock att kräva fler djur för att uppnå provstorleken för önskad statistisk kraft. Antalet tumörceller som så småningom etablerar sig i hjärnan via dessa intrakardiella och intravenösa injektionsmetoder varierar. Därför kan hjärnmetastaseringstumörbördan variera mellan djur och skillnaden i progression kan göra standardisering av den experimentella tidslinjen och tolkningen av resultat till en utmaning. Den extrakraniella tumörbördan kan leda till dödlighet utan hjärnmetastaser, vilket gör dessa modeller olämpliga för utvärdering av intrakraniell effekt. Hjärn-tropiska cellinjer har etablerats med hjälp av artificiella klonala selektionsprocesser för att minska extrakraniell etablering, men upptagningshastigheterna har varit inkonsekventa och den klonala urvalsprocessen kan minska heterogeniteten som normalt finns i mänskliga tumörer³².

Hjärnspecifika engraftmentmetoder som intrakraniell och intrakarotisinjektion möjliggör mer konsekvent och effektiv hjärnmetastaseringsmodellering. I den intrakraniella metoden³³ injiceras cancerceller vanligtvis i den främre hjärnbarken, vilket genererar snabb och reproducerbar tumörutväxt med lågt systemiskt engagemang. Även om proceduren tolereras väl med låg dödlighet³³, är försiktighetsåtgärderna att det är ett relativt grovt tillvägagångssätt som snabbt introducerar en (lokaliserad) bolus av celler i hjärnan och inte modellerar tidig hjärnmetastaseringspatogenes. Nålen skadar hjärnvävnadskärlen, som då orsakar lokaliserad inflammation ^5,34. Av erfarenhet finns det en tendens att tumörcellinjektat återflöde under avlägsnande av nålen, vilket leder till leptomeningeal involvering. Alternativt levererar intracarotidmetoden celler till den gemensamma halspulsådern med hjärnmikrovaskulatur som den första kapillärbädden som påträffas, modelleringsöverlevnad i cirkulation, extravasation och kolonisering²⁴. I överensstämmelse med andra²⁵ fann vår erfarenhet av denna metod att den kan resultera i ansiktstumörer på grund av oavsiktlig leverans av cancerceller via den yttre halspulsådern till kapillärbäddar i dessa vävnader (opublicerade data). Det är möjligt att förhindra ansiktstumörer genom att först ligera den yttre halspulsådern före vanlig halspulsåderinjektion (figur 1). I resten av artikeln kallas denna metod för “inre halspulsåderinjektion”. Av erfarenhet genererar den inre halspulsåderinjektionsmetoden konsekvent hjärnmetastaser med mycket få systemiska händelser och har lyckats generera hjärnmetastaseringsmodeller av olika primära cancerformer (t.ex. melanom, bröst- och lungcancer) (Figur 1). Nackdelarna är att det är tekniskt utmanande, tidskrävande, invasivt och kräver noggrann optimering av cellnummer och en övervakningstidslinje. Sammanfattningsvis producerar både intrakraniella och interna halspulsåderinjektionsmetoder musmodeller som är lämpliga för att utvärdera terapeutisk inverkan på hjärntumörrelaterad överlevnadsfördel.

Detta protokoll beskriver den interna halspulsåderinjektionsmetoden för att producera en musmodell av hjärnmetastaser med nästan ingen systemisk inblandning och därför lämplig för preklinisk utvärdering av läkemedelsdistribution och effekt av experimentella terapier.

Figur 1: Schematisk representation av internt halspulsåderinjektionsprotokoll för hjärnmetastaser. Intern halspulsåderinjektion med extern halspulsåderligering kan på ett tillförlitligt sätt producera en hjärnmetastaseringsmodell från olika primära cancerformer. I detta protokoll placeras tre ligaturer på halspulsådern (kommenterad som L1-L3 i figuren). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla studier genomfördes inom riktlinjerna för djuretikkommittén vid University of Queensland (UQCCR/186/19) och den australiska koden för vård och användning av djur för vetenskapligt ändamål. 1. Beredning av cancerceller för injektion OBS: I denna studie användes den mänskliga bröstcancercellinjen, BT-474 (BT474). BT474 odlades i fullständigt tillväxtmedium bestående av RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1%…

Representative Results

Jämförelse av vanlig halspulsåderinjektion med eller utan yttre halspulsåderligeringNär cancerceller injicerades via den gemensamma halspulsådern utan att först ligera yttre halspulsåder24, hittades ansiktstumörer hos 77,8% av de ympade mössen (n = 7/9 djur). Ett exempel på ansiktstumör illustreras i kompletterande figur 3. Metoden som beskrivs i detta protokoll förhindrar oavsiktlig ansiktsmetastasering genom att ligera den yttr…

Discussion

Hjärnmetastaser är en komplex process av cancerceller som sprider sig från deras primära plats till hjärnan. Olika djurmodeller finns tillgängliga som speglar vissa stadier i denna flerstegsprocess och det finns fysiologiska och praktiska överväganden för att utforma prekliniska metastaseringsstudier^41,42. De flesta publicerade studier som undersöker användningen av nanomedicin för behandling av hjärnmetastaser har använt intrakardiella<sup class="x…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010