음향유체 마이크로장치를 기반으로 한 세포 및 핵의 압축성 측정
Summary
여기에서는 음향 유체 마이크로 장치를 기반으로 세포 또는 핵 압축성을 측정하기위한 빠르고 비파괴적인 시스템을 구축하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 상피-중간엽 전이 또는 전리 방사선 후 종양 세포의 기계적 특성 변화를 조사하여 과학 연구 및 임상 실습에서이 방법의 적용 가능성을 입증했습니다.
Abstract
세포 역학은 종양 전이, 세포의 악성 형질 전환 및 방사선 민감성에 중요한 역할을합니다. 이러한 과정에서 세포의 기계적 특성을 연구하는 것은 종종 어려운 일입니다. 압축 또는 스트레칭과 같은 접촉을 기반으로 하는 기존의 측정 방법은 세포 손상을 일으키기 쉽고 측정 정확도 및 후속 세포 배양에 영향을 미칩니다. 부착 상태에서의 측정은 특히 전리 방사선이 세포를 평평하게 하고 접착력을 향상시키기 때문에 조사 후 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서는 음향 유체 방법에 기반한 세포 역학 측정 시스템이 개발되었습니다. 세포 압축성은 음력의 작용하에 세포 운동 궤적을 기록하여 얻을 수 있으며, 이는 부유 상태에서 빠르고 비파괴적인 측정을 실현할 수 있습니다. 이 백서는 칩 설계, 샘플 준비, 궤적 기록, 매개 변수 추출 및 분석을위한 프로토콜을 자세히보고합니다. 상이한 유형의 종양 세포의 압축성은 이 방법에 기초하여 측정되었다. 핵의 압축성의 측정은 또한 압전 세라믹의 공명 주파수와 마이크로 채널의 폭을 조정함으로써 달성되었다. 면역형광 실험의 분자 수준 검증과 결합하여 약물 유도 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT) 전후의 세포 압축성을 비교했습니다. 또한, 상이한 선량으로 X 선 조사 후 세포 압축성의 변화가 밝혀졌다. 이 논문에서 제안한 세포 역학 측정 방법은 보편적이고 유연하며 과학 연구 및 임상 실습에서 광범위한 응용 전망을 가지고 있습니다.
Introduction
세포의 기계적 특성은 종양 전이, 세포의 악성 형질 전환 및 방사선 민감성 1,2에 중요한 역할을합니다. 위의 과정에서 세포 기계적 특성의 역할에 대한 심층적 인 이해를 얻으려면 세포 역학의 정확한 측정이 중요하며 측정은 후속 배양 및 분석을 위해 세포에 손상을 일으키지 않아야합니다. 측정 과정은 가능한 한 빨라야 하며, 그렇지 않으면 세포가 배양 환경에서 장기간 제거되면 세포 생존율에 영향을 미칠 수 있습니다.
기존의 세포 역학 측정 방법은 몇 가지 한계에 직면해 있습니다. 자기 비틀림 세포 분석, 자기 핀셋 및 입자 추적 미세 유변학과 같은 일부 방법은 세포 3,4,5에 입자가 도입되어 세포손상을 일으 킵니다. 원자력 현미경(AFM), 마이크로피펫 흡인, 미세 수축 및 평행판 기술과 같이 세포와의 접촉으로 측정하는 방법도 세포 손상이 발생하기 쉽고 처리량을 증가시키기가 어렵습니다 6,7,8. 또한 전리 방사선은 세포를 평평하게하고 접착력을 증가시킵니다9; 따라서 현탁액에서 전체 세포 역학을 측정해야 합니다.
위의 과제에 대응하여 음향 유체 방법10,11,12,13,14에 기반한 세포 역학 측정 시스템이 개발되었습니다. 채널 폭은 음향 반파장과 일치하여 마이크로 채널의 정중선에 정상파 노드를 생성합니다. 음향 복사력의 작용으로 셀 또는 표준 비드는 음향 압력 노드로 이동할 수 있습니다. 표준 비드의 물리적 특성(크기, 밀도 및 압축성)이 알려져 있기 때문에, 음향 에너지 밀도가 결정될 수 있다. 이어서, 셀 압축성은 음장에서 셀의 운동 궤적을 기록함으로써 얻어질 수 있다. 부유 상태의 세포의 비파괴 고처리량 측정을 달성할 수 있습니다. 이 백서에서는 미세 유체 칩의 설계, 시스템 구축 및 측정 단계를 소개합니다. 상기 방법의 정확성을 검증하기 위해 다양한 형태의 종양 세포의 측정이 수행되었다. 이 방법의 적용 범위는 압전 세라믹의 공명 주파수와 마이크로 채널의 폭을 조정하여 세포 내 구조 (예 : 핵)로 확장되었습니다. 또한, 약물 유도 EMT 또는 다른 용량의 X 선 조사 후 세포 압축성의 변화를 조사했다. 결과는 생화학적 변화와 세포의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하기 위한 강력한 도구로서 이 방법의 광범위한 적용 가능성을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일반적으로 사용되는 세포 역학 측정 방법은 AFM, 마이크로 피펫 흡인, 미세 유체 방법, 병렬 플레이트 기술, 광학 핀셋, 광학 들것 및 음향 방법20입니다. 미세 유체 학적 방법은 미세 수축, 확장 흐름 및 전단 흐름의 세 가지 접근 방식으로 작동 할 수 있습니다. 그 중 광학 들것, 광학 핀셋, 음향 방법, 확장 흐름 및 전단 흐름 접근 방식은 비접촉 측정입니다. 접촉 측정과 달리 비접…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 12075330 및 U1932165)과 중국 광동성 자연 과학 재단(보조금 번호 2020A1515010270)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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