Misura della comprimibilità di cellula e nucleo basata su microdispositivo acustofluidico
Summary
Qui viene presentato un protocollo per costruire un sistema veloce e non distruttivo per misurare la comprimibilità di cellule o nuclei basato su microdispositivo acustofluidico. Sono stati studiati i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule tumorali dopo transizione epiteliale-mesenchimale o radiazioni ionizzanti, dimostrando la prospettiva applicativa di questo metodo nella ricerca scientifica e nella pratica clinica.
Abstract
La meccanica cellulare svolge un ruolo importante nelle metastasi tumorali, nella trasformazione maligna delle cellule e nella radiosensibilità. Durante questi processi, studiare le proprietà meccaniche delle cellule è spesso impegnativo. I metodi di misurazione convenzionali basati sul contatto, come la compressione o lo stiramento, sono inclini a causare danni alle cellule, influenzando l’accuratezza della misurazione e la successiva coltura cellulare. Le misurazioni in stato aderente possono anche influenzare l’accuratezza, specialmente dopo l’irradiazione poiché le radiazioni ionizzanti appiattiscono le cellule e migliorano l’adesione. Qui è stato sviluppato un sistema di misura della meccanica cellulare basato sul metodo acustofluidico. La comprimibilità della cella può essere ottenuta registrando la traiettoria di movimento della cella sotto l’azione della forza acustica, che può realizzare misure rapide e non distruttive in stato sospeso. Questo documento riporta in dettaglio i protocolli per la progettazione di chip, la preparazione dei campioni, la registrazione della traiettoria, l’estrazione e l’analisi dei parametri. La comprimibilità di diversi tipi di cellule tumorali è stata misurata sulla base di questo metodo. La misurazione della comprimibilità del nucleo è stata ottenuta anche regolando la frequenza di risonanza della ceramica piezoelettrica e la larghezza del microcanale. In combinazione con la verifica a livello molecolare degli esperimenti di immunofluorescenza, è stata confrontata la comprimibilità cellulare prima e dopo la transizione epiteliale-mesenchimale indotta da farmaci (EMT). Inoltre, è stato rivelato il cambiamento di comprimibilità cellulare dopo l’irradiazione a raggi X con dosi diverse. Il metodo di misurazione della meccanica cellulare proposto in questo articolo è universale e flessibile e ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca scientifica e nella pratica clinica.
Introduction
Le proprietà meccaniche cellulari svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali, nella trasformazione maligna delle cellule e nella radiosensibilità 1,2. Per ottenere una comprensione approfondita del ruolo delle proprietà meccaniche delle cellule nel processo di cui sopra, la misurazione accurata della meccanica cellulare è fondamentale e la misurazione non dovrebbe causare danni alle cellule per la successiva coltura e analisi. Il processo di misurazione dovrebbe essere il più veloce possibile, altrimenti la vitalità cellulare potrebbe essere compromessa se le cellule vengono rimosse dall’ambiente di coltivazione per lungo tempo.
I metodi di misurazione della meccanica cellulare esistenti devono affrontare alcune limitazioni. Alcuni metodi, come la citometria a torsione magnetica, le pinzette magnetiche e la microreologia a tracciamento delle particelle, causano danni cellulari a causa dell’introduzione di particelle nelle cellule 3,4,5. I metodi che misurano per contatto con le cellule, come il microscopio a forza atomica (AFM), l’aspirazione con micropipette, la microcostrizione e la tecnica a piastre parallele, sono anche soggetti a danni cellulari e il rendimento è difficile da aumentare 6,7,8. Inoltre, le radiazioni ionizzanti appiattiranno le cellule e aumenteranno la loro adesione9; È quindi necessario misurare la meccanica dell’intera cellula in sospensione.
In risposta alle sfide di cui sopra, è stato sviluppato un sistema di misura della meccanica cellulare basato sul metodo acustofluidico 10,11,12,13,14. La larghezza del canale è abbinata alla mezza lunghezza d’onda acustica, creando così un nodo d’onda stazionario sulla linea mediana del microcanale. Sotto l’azione della forza della radiazione acustica, le celle o le sfere standard possono spostarsi verso il nodo di pressione acustica. Poiché le proprietà fisiche delle sfere standard (dimensioni, densità e comprimibilità) sono note, è possibile determinare la densità di energia acustica. Quindi, la comprimibilità cellulare può essere ottenuta registrando le traiettorie di movimento delle cellule nel campo acustico. È possibile ottenere misurazioni non distruttive ad alta produttività di celle in stato di sospensione. Questo documento introdurrà la progettazione del chip microfluidico, la creazione del sistema e le fasi di misurazione. La misurazione di vari tipi di cellule tumorali è stata effettuata per verificare l’accuratezza del metodo. L’ambito di applicazione di questo metodo era stato esteso alle strutture subcellulari (come il nucleo) regolando la frequenza di risonanza della ceramica piezoelettrica e la larghezza del microcanale. Inoltre, sono stati studiati i cambiamenti nella comprimibilità cellulare dopo EMT indotta da farmaci o irradiazione a raggi X con dosi diverse. I risultati dimostrano l’ampia applicabilità di questo metodo come potente strumento per studiare la correlazione tra cambiamenti biochimici e proprietà meccaniche cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi di misurazione della meccanica cellulare comunemente usati sono AFM, aspirazione di micropipette, metodi di microfluidica, tecnica a piastre parallele, pinzette ottiche, barelle ottiche e metodi acustici20. I metodi di microfluidica possono funzionare con tre approcci: micro-costrizione, flusso estensionale e flusso di taglio. Tra questi, barella ottica, pinzette ottiche, metodi acustici, flusso estensionale e approcci di flusso di taglio sono misurazioni senza contatto. A differenza dell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 12075330 e U1932165) e dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong, Cina (numero di sovvenzione 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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