基于声流控微装置的细胞与细胞核压缩性测量

摘要

本文介绍了一种基于声流控微装置的快速、无损测量细胞或细胞核可压缩性的方法。通过该方法研究了肿瘤细胞在上皮-间质转化或电离辐射后力学特性的变化，展示了该技术在科学研究与临床实践中的应用前景。

摘要

细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中发挥着重要作用。在这些过程中，研究细胞的力学特性往往具有挑战性。基于接触的传统测量方法（如压缩或拉伸）容易造成细胞损伤，影响测量精度以及后续的细胞培养。在贴壁状态下进行测量也会影响准确性，尤其是在电离辐射后，因为辐射会使细胞变扁平并增强其贴附性。本文开发了一种基于声流控技术的细胞力学测量系统。通过记录细胞在声力作用下的运动轨迹，可获得细胞的可压缩性，从而实现悬浮状态下的快速、无损测量。本文详细报道了芯片设计、样品制备、轨迹记录、参数提取与分析的实验方案。基于该方法，测量了多种肿瘤细胞的可压缩性。通过调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度，还实现了对细胞核可压缩性的测量。结合免疫荧光实验在分子水平的验证，比较了药物诱导上皮-间质转化（EMT）前后细胞可压缩性的变化。进一步揭示了不同剂量X射线辐照后细胞可压缩性的变化。本文提出的细胞力学测量方法具有通用性和灵活性，在科学研究与临床实践中具有广泛的应用前景。

引言

细胞力学特性在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中起着重要作用^1,2。为了深入理解细胞力学特性在上述过程中的作用，准确测量细胞力学性能至关重要，且测量过程不应影响细胞的后续培养与分析。测量过程应尽可能快速，否则若细胞长时间脱离培养环境，其活性可能受到影响。

现有的细胞力学测量方法存在一些局限性。某些方法，如磁扭转细胞仪、磁镊和粒子追踪微流变学，由于将颗粒引入细胞而容易造成细胞损伤^3,4,5。与细胞接触式测量的方法，如原子力显微镜（AFM）、微吸管抽吸、微收缩通道和平行板技术，也容易导致细胞损伤，且通量难以提高^6,7,8。此外，电离辐射会使细胞变扁并增强其黏附性⁹；因此，有必要在悬浮状态下对完整细胞的力学性质进行测量。

针对上述挑战，已开发出一种基于声流控方法

方案

1. 声流控微装置的制备与组装

1. 微流控芯片的制备
   1. 设计一个仅有一个入口和一个出口的单通道芯片，如图所示 图1用于测量细胞时，保持微通道的矩形横截面 740 µm 宽 100 µm 深。为测量细胞核，需改变微通道的宽度和深度 250 µm 和 100 µm分别。
   2. 在硅片上制备微通道 通过 反应离子刻蚀。通过阳极键合将一块透明耐热玻璃密封在微通道顶部¹⁵用超声波清洗器清洗芯片10分钟，然后在干燥箱中干燥 50 °C 以备后续使用。
2. 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）块。
   1. 向一个直径为100 mm的玻璃培养皿中加入30 mL预聚物。用注射器向预聚物中加入3 mL固化剂。
      注意：固化剂与预聚物的体积比为1:10。
   2. 用玻璃棒剧烈搅拌PDMS预聚物和固化剂约10分钟。观察溶液中是否出现细小且均匀分散的气泡，这表明PDMS预聚物与固化剂已充分混合。
   3. 将玻璃培养皿放入真空干燥器中，抽真空15-25秒。重复此过程，直至混合物中无气泡。
   4. 将玻璃培养皿放入设定温度的干燥烘箱中 50 °C 孵育1小时，使混合物固化。孵育结束后，用手术刀将PDMS切割成大小合适的块状，每块长约1.2 c....

结果

本文介绍了一种基于声流控微装置的快速、非破坏性细胞可压缩性测量系统的构建方案，并展示了其在不同条件下测量细胞及细胞核的优越性。图1展示了微流控通道的示意图。声流控微装置的组成与组装如图2所示。图3展示了测量系统的装置示意图。在声场力的作用下，细胞和颗粒将向微通道中线移动，如图4A所示。细胞或颗粒的尺寸与位置测量如图5所示。通过拟合计算能量密度与细胞可压缩性的方法如图6所示。为了将该装置的应用范围拓展至细胞器，特别是细胞核，实验中从细胞中分离出高纯度且完整的细胞核（图7A）。通过相应调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度，获得了细胞核的运动轨迹（图4B），并实现了细胞核.......

讨论

常用的细胞力学测量方法包括原子力显微镜（AFM）、微吸管抽吸、微流控方法、平行板技术、光镊、光拉伸器以及声学方法²⁰。微流控方法可通过三种方式实现：微收缩、拉伸流和剪切流。其中，光拉伸器、光镊、声学方法、拉伸流和剪切流属于非接触式测量。与接触式测量相比，非接触式测量能有效避免因接触或局部形变引起的细胞损伤问题。光镊对测量环境非常敏感²¹，光学条件的扰动可能导致测量结果出现显著差异，且测量过程中较高的激光功率也可能造成细胞损伤。此外，光拉伸器和光镊通常通量较低^20,22。微流控方法中的拉伸流和剪切流无法直接测量肿瘤细胞的微力学特性²³。与其他方法相比，声学方法在细胞力学测量中具有无损、高通量和广泛适用性的优势。

本文设计的基于声流控微装置的测量方法利用非接触式的声辐射力，最大的优势在于不会对细胞造成损伤，这一点已通过本文展示的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶(1x)	GIBCO	15050-065
502 胶水	Evo-bond		氰基丙烯酸酯胶水
A549	ATCC	CCL-185	肺腺癌细胞系
胞核蛋白与胞质蛋白提取试剂盒	Beyotime	P0027	包含胞质蛋白提取试剂 A 和 B
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)	Corning	10-013-CVRC
胎牛血清 (FBS)	AUSGENEX	FBS500-S
HCT116	ATCC	CCL247	结直肠癌细胞系
耐热玻璃	Pyrex
Leibovitz’s L-15 培养基	GIBCO	11415-064
MCF-7	ATCC	HTB-22	乳腺腺癌细胞系
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	乳腺腺癌细胞系
最低必需培养基 (MEM)	Corning	10-010-CV
青霉素-链霉素	GIBCO	15140-122
磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-cvc
PMSF	Beyotime	ST506	100 mM
Polybead 聚苯乙烯红色染色微球	Polysciences	15714	微球直径为 6.00µm
碘化丙啶 (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体	Dow-Corning	1673921	包含预聚物和固化剂
台盼蓝	Beyotime	C0011