Medição da Compressão de Células e Núcleos Baseados em Microdevice Acoustofluidic
Summary
Aqui é apresentado um protocolo para construir um sistema rápido e não destrutivo para medir a compressão celular ou núcleo com base em microdispositivos acoustofluidos. Foram investigadas alterações nas propriedades mecânicas das células tumorais após transição epitelial-mesenquimal ou radiação ionizante, demonstrando a perspectiva de aplicação desse método em pesquisa científica e prática clínica.
Abstract
A mecânica celular desempenha um papel importante na metástase tumoral, transformação maligna das células e radiosensibilidade. Durante esses processos, estudar as propriedades mecânicas das células é muitas vezes desafiador. Métodos convencionais de medição baseados em contato, como compressão ou alongamento, são propensos a causar danos celulares, afetando a precisão da medição e a cultura celular subsequente. Medições em estado de aderente também podem afetar a precisão, especialmente após a irradiação, uma vez que a radiação ionizante irá achatar as células e aumentar a adesão. Aqui, foi desenvolvido um sistema de medição de mecânica celular baseado no método acoustofluido. A compressão celular pode ser obtida registrando a trajetória de movimento celular sob a ação da força acústica, que pode realizar uma medição rápida e não destrutiva em estado suspenso. Este artigo relata detalhadamente os protocolos para design de chips, preparação de amostras, registro de trajetória, extração e análise de parâmetros. A compressão de diferentes tipos de células tumorais foi medida com base neste método. A medição da compressão do núcleo também foi obtida pelo ajuste da frequência de ressonância da cerâmica piezoelétrica e da largura do microcanal. Combinada com a verificação do nível molecular dos experimentos de imunofluorescência, a compressão celular antes e depois da epitelial induzida por drogas à transição mesenquimal (EMT) foram comparadas. Além disso, foi revelada a mudança da compressão celular após a irradiação de raios-X com doses diferentes. O método de medição da mecânica celular proposto neste artigo é universal e flexível e possui amplas perspectivas de aplicação em pesquisa científica e prática clínica.
Introduction
As propriedades mecânicas celulares desempenham um papel importante na metástase tumoral, transformação maligna das células e radiosensibilidade 1,2. Para obter uma compreensão aprofundada do papel das propriedades mecânicas celulares no processo acima, a medição precisa da mecânica celular é crítica, e a medição não deve causar danos às células para posterior cultura e análise. O processo de medição deve ser o mais rápido possível, caso contrário, a viabilidade celular pode ser afetada se as células forem removidas do ambiente de cultivo por um longo tempo.
Os métodos de medição da mecânica celular existentes enfrentam algumas limitações. Alguns métodos, como citometria de torção magnética, pinças magnéticas e microrreheologia de rastreamento de partículas, causam danos celulares devido à introdução de partículas nas células 3,4,5. Métodos que medem pelo contato com células, como microscópio de força atômica (AFM), aspiração de micropipette, microcostrição e técnica de placa paralela, também são propensos a danos celulares e o throughput é difícil de aumentar 6,7,8. Além disso, a radiação ionizante irá achatar as células e aumentar sua adesão9; por isso, é necessário medir toda a mecânica celular em suspensão.
Em resposta aos desafios acima, foi desenvolvido um sistema de medição de mecânica celular baseado no método acoustofluidic 10,11,12,13,14. A largura do canal é combinada com o comprimento de onda acústico, criando assim um nó de onda em pé na linha média do microcanal. Sob a ação da força de radiação acústica, as células ou contas padrão podem se mover para o nó de pressão acústica. Uma vez que as propriedades físicas das contas padrão (tamanho, densidade e compressão) são conhecidas, a densidade de energia acústica pode ser determinada. Em seguida, a compressão celular pode ser obtida registrando as trajetórias de movimento das células no campo acústico. A medição não destrutiva de alta produtividade das células em estado de suspensão pode ser alcançada. Este artigo introduzirá o desenho do chip microfluido, o estabelecimento do sistema e as etapas de medição. A medição de vários tipos de células tumorais foi realizada para verificar a exatidão do método. O escopo de aplicação deste método foi estendido para estruturas subcelulares (como núcleo) ajustando a frequência de ressonância da cerâmica piezoelétrica e a largura do microcanal. Além disso, foram investigadas as alterações na compressão celular após a irradiação de paramédicos ou raios-X induzidos por drogas com diferentes doses. Os resultados demonstram a ampla aplicabilidade deste método como uma poderosa ferramenta para estudar a correlação entre alterações bioquímicas e propriedades mecânicas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos de medição da mecânica celular comumente utilizados são AFM, aspiração de micropipette, métodos de microfluidos, técnica de placa paralela, pinça óptica, maca óptica e métodos acústicos20. Os métodos de microfluidos podem trabalhar com três abordagens: micro-constrição, fluxo extensal e fluxo de cisalhamento. Entre elas, maca óptica, pinça óptica, métodos acústicos, fluxo extensão e abordagens de fluxo de cisalhamento são medidas sem contato. Em contraste com as…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant numbers 12075330 e U1932165) e pela Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Grant number 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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