Måling af kompressibiliteten af celle og kerne baseret på akustofluidisk mikroenhed
Summary
Her præsenteres en protokol for at opbygge et hurtigt og ikke-destruktivt system til måling af celle- eller kernekompressibilitet baseret på akustofluidisk mikroenhed. Ændringer i tumorcellernes mekaniske egenskaber efter epitel-mesenkymal overgang eller ioniserende stråling blev undersøgt, hvilket demonstrerede anvendelsesudsigten for denne metode i videnskabelig forskning og klinisk praksis.
Abstract
Cellemekanik spiller en vigtig rolle i tumormetastase, ondartet transformation af celler og radiofølsomhed. Under disse processer er det ofte udfordrende at studere cellernes mekaniske egenskaber. Konventionelle målemetoder baseret på kontakt såsom kompression eller strækning er tilbøjelige til at forårsage celleskader, hvilket påvirker målenøjagtigheden og efterfølgende cellekultur. Målinger i vedhæftet tilstand kan også påvirke nøjagtigheden, især efter bestråling, da ioniserende stråling vil flade celler og forbedre vedhæftningen. Her er der udviklet et cellemekanisk målesystem baseret på akustofluidisk metode. Cellekompressibiliteten kan opnås ved at registrere cellebevægelsesbanen under virkningen af den akustiske kraft, som kan realisere hurtig og ikke-destruktiv måling i suspenderet tilstand. Dette papir rapporterer detaljeret protokollerne for chipdesign, prøveforberedelse, baneregistrering, parameterekstraktion og analyse. Kompressibiliteten af forskellige typer tumorceller blev målt ud fra denne metode. Måling af kernens kompressibilitet blev også opnået ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og mikrokanalens bredde. Kombineret med verifikation på molekylært niveau af immunfluorescensforsøg blev cellekompressibiliteten før og efter lægemiddelinduceret epitel til mesenkymal overgang (EMT) sammenlignet. Endvidere blev ændringen af cellekompressibilitet efter røntgenbestråling med forskellige doser afsløret. Cellemekanik målemetoden, der foreslås i dette papir, er universel og fleksibel og har brede anvendelsesmuligheder inden for videnskabelig forskning og klinisk praksis.
Introduction
Cellemekaniske egenskaber spiller en vigtig rolle i tumormetastase, ondartet transformation af celler og radiosensitivitet 1,2. For at få en dybdegående forståelse af cellemekaniske egenskabers rolle i ovenstående proces er nøjagtig måling af cellulær mekanik kritisk, og målingen bør ikke forårsage skade på cellerne til efterfølgende dyrkning og analyse. Måleprocessen skal være så hurtig som muligt, ellers kan cellelevedygtigheden blive påvirket, hvis celler fjernes fra dyrkningsmiljøet i lang tid.
Eksisterende cellemekaniske målemetoder står over for nogle begrænsninger. Nogle metoder, såsom magnetisk vridningscytometri, magnetisk pincet og partikelsporingsmikroreologi, forårsager celleskader på grund af indførelsen af partikler i celler 3,4,5. Metoder, der måler ved kontakt med celler, såsom atomkraftmikroskop (AFM), mikropipetteaspiration, mikroindsnævring og parallelpladeteknik, er også tilbøjelige til celleskader, og gennemstrømningen er vanskelig at øge 6,7,8. Derudover vil ioniserende stråling flade celler og øge deres vedhæftning9; Det er derfor nødvendigt at måle helcellemekanik i suspension.
Som svar på ovenstående udfordringer er der udviklet et cellemekanikmålesystem baseret på acoustofluidisk metode 10,11,12,13,14. Kanalbredden matches med den akustiske halvbølgelængde, hvilket skaber en stående bølgeknude ved mikrokanalens midterlinje. Under virkningen af akustisk strålingskraft kan cellerne eller standardperlerne flytte til den akustiske trykknude. Da standardperlernes fysiske egenskaber (størrelse, densitet og kompressibilitet) er kendt, kan den akustiske energitæthed bestemmes. Derefter kan cellekompressibiliteten opnås ved at registrere bevægelsesbanerne for celler i det akustiske felt. Ikke-destruktiv måling af høj kapacitet af celler i suspensionstilstand kan opnås. Dette papir vil introducere designet af den mikrofluidiske chip, etableringen af systemet og måletrinnene. Måling af forskellige typer tumorceller er blevet udført for at verificere metodens nøjagtighed. Anvendelsesområdet for denne metode var blevet udvidet til subcellulære strukturer (såsom kerne) ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og bredden af mikrokanalen. Desuden blev ændringerne i cellekompressibilitet efter lægemiddelinduceret EMT eller røntgenbestråling med forskellige doser undersøgt. Resultaterne viser den brede anvendelighed af denne metode som et kraftfuldt værktøj til at studere sammenhængen mellem biokemiske ændringer og cellulære mekaniske egenskaber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Almindeligt anvendte cellemekaniske målemetoder er AFM, mikropipetteaspiration, mikrofluidikmetoder, parallelpladeteknik, optisk pincet, optisk båre og akustiske metoder20. Microfluidics-metoder kan arbejde med tre tilgange: mikroindsnævring, ekstensiv strømning og forskydningsstrøm. Blandt dem er optisk båre, optisk pincet, akustiske metoder, ekstensiv strømning og forskydningsstrømningsmetoder ikke-kontaktmålinger. I modsætning til kontaktmålinger kan berøringsfri målinger effektivt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskudsnumre 12075330 og U1932165) og Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (tilskudsnummer 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
References
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
