Måling av kompressibiliteten til celle og kjerne basert på akustofluidisk mikrodevice
Summary
Her presenteres en protokoll for å bygge et raskt og ikke-destruktivt system for måling av celle- eller kjernekompressibilitet basert på akustofluidisk mikrodevice. Endringer i mekaniske egenskaper av tumorceller etter epitel-mesenkymal overgang eller ioniserende stråling ble undersøkt, og demonstrerte anvendelsesutsiktene for denne metoden i vitenskapelig forskning og klinisk praksis.
Abstract
Cellemekanikk spiller en viktig rolle i tumormetastase, ondartet transformasjon av celler og radiosensitivitet. Under disse prosessene er det ofte utfordrende å studere de mekaniske egenskapene til cellene. Konvensjonelle målemetoder basert på kontakt som kompresjon eller strekking er tilbøyelige til å forårsake celleskade, noe som påvirker målenøyaktigheten og påfølgende cellekultur. Målinger i adherent tilstand kan også påvirke nøyaktigheten, spesielt etter bestråling siden ioniserende stråling vil flate celler og forbedre vedheft. Her er det utviklet et cellemekanisk målesystem basert på akustofluidisk metode. Cellekomprimerbarheten kan oppnås ved å registrere cellebevegelsesbanen under virkningen av den akustiske kraften, som kan realisere rask og ikke-destruktiv måling i suspendert tilstand. Dette papiret rapporterer i detalj protokollene for chipdesign, prøvepreparering, baneopptak, parameterutvinning og analyse. Kompressibiliteten til forskjellige typer tumorceller ble målt basert på denne metoden. Måling av kompressibiliteten til kjernen ble også oppnådd ved å justere resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken og bredden på mikrokanalen. Kombinert med molekylær nivåverifisering av immunfluorescenseksperimenter ble cellekompressibiliteten før og etter legemiddelindusert epitel til mesenkymal overgang (EMT) sammenlignet. Videre ble endringen av cellekomprimerbarhet etter røntgenbestråling med forskjellige doser avslørt. Den cellemekaniske målemetoden som foreslås i dette papiret er universell og fleksibel og har brede applikasjonsutsikter i vitenskapelig forskning og klinisk praksis.
Introduction
Cellemekaniske egenskaper spiller en viktig rolle i tumormetastase, ondartet transformasjon av celler og radiosensitivitet 1,2. For å få en grundig forståelse av rollen til cellemekaniske egenskaper i prosessen ovenfor, er nøyaktig måling av cellulær mekanikk kritisk, og målingen skal ikke forårsake skade på cellene for etterfølgende kultur og analyse. Måleprosessen bør være så rask som mulig, ellers kan cellens levedyktighet påvirkes hvis celler fjernes fra dyrkingsmiljøet i lang tid.
Eksisterende målemetoder for cellemekanikk står overfor noen begrensninger. Noen metoder, som magnetisk vridningscytometri, magnetisk pinsett og partikkelsporingsmikroreologi, forårsaker celleskader på grunn av innføring av partikler i celler 3,4,5. Metoder som måles ved kontakt med celler, som atomkraftmikroskop (AFM), mikropipetteaspirasjon, mikroinnsnevring og parallellplateteknikk, er også utsatt for celleskader og gjennomstrømningen er vanskelig å øke 6,7,8. I tillegg vil ioniserende stråling flate ut celler og øke deres vedheft9; Det er derfor nødvendig å måle helcellemekanikk i suspensjon.
Som svar på de ovennevnte utfordringene er det utviklet et cellemekanisk målesystem basert på akustofluidisk metode 10,11,12,13,14. Kanalbredden er tilpasset den akustiske halvbølgelengden, og skaper dermed en stående bølgenode ved mikrokanalens midtlinje. Under virkningen av akustisk strålingskraft kan cellene eller standardperlene bevege seg til den akustiske trykknoden. Siden de fysiske egenskapene til standardkulene (størrelse, tetthet og komprimerbarhet) er kjent, kan den akustiske energitettheten bestemmes. Deretter kan cellekompressibiliteten oppnås ved å registrere bevegelsesbanene til celler i det akustiske feltet. Ikke-destruktiv måling av høy gjennomstrømning av celler i suspensjonstilstand kan oppnås. Dette papiret vil introdusere utformingen av den mikrofluidiske brikken, etableringen av systemet og måletrinnene. Måling av ulike typer tumorceller er utført for å verifisere nøyaktigheten av metoden. Anvendelsesområdet for denne metoden hadde blitt utvidet til subcellulære strukturer (som kjerne) ved å justere resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken og bredden på mikrokanalen. I tillegg ble endringene i cellekomprimerbarhet etter medikamentindusert EMT eller røntgenbestråling med ulike doser undersøkt. Resultatene viser den brede anvendeligheten av denne metoden som et kraftig verktøy for å studere sammenhengen mellom biokjemiske endringer og cellulære mekaniske egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanlige målemetoder for cellemekanikk er AFM, mikropipetteaspirasjon, mikrofluidikkmetoder, parallellplateteknikk, optisk pinsett, optisk båre og akustiske metoder20. Mikrofluidikkmetoder kan fungere med tre tilnærminger: mikroinnsnevring, ekstensjonsstrømning og skjærstrøm. Blant dem er optisk båre, optisk pinsett, akustiske metoder, ekstensjonsstrøm og skjærstrømningstilnærminger ikke-kontaktmålinger. I motsetning til kontaktmålinger kan ikke-kontaktmålinger effektivt unngå celles…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nummer 12075330 og U1932165) og Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (Grant nummer 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
References
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
