הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED
Summary
הפרוטוקול הנוכחי פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של גישה זו הם שהיא בטוחה, יעילה, זולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית.
Abstract
כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) היא טכניקה אנליטית נגישה שנעשה בה שימוש נרחב במחקר בכימיה אורגנית כדי לכמת את התשואה של דגימות לא ידועות. המחקר הנוכחי פיתח שיטה יעילה, זולה ובטוחה להעריך את תפוקת הדגימות על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה. לובסטטין שהופק מאספרגילוס טראוס היה התרכובת לדוגמה ששימשה במחקר הנוכחי. מודלים של רגרסיה המבוססים על תקן lovastatin שימשו להערכת התשואה של lovastatin. הושוו שלוש שיטות: ביו-אסאי, גילוי UV ותאורת LED כחולה. התוצאה הראתה כי שיטת התאורה blue-LED יעילה הרבה יותר בזמן מאשר שיטות זיהוי UV ובדיקת ביולוגיה. בנוסף, תאורת ה-LED הכחולה הייתה אופציה בטוחה יחסית בגלל החשש מסכנות ביולוגיות בשיטת הביו-אסאי (למשל, זיהום מיקרוביאלי) וחשיפה לקרינה אולטרה סגולה בשיטת גילוי ה-UV. בהשוואה לשיטות היקרות הדורשות מכשירים מיוחדים והכשרה ארוכת טווח לפני עבודה עצמאית, כגון GC, HPLC ו- HPTLC, השימוש בתאורת Blue-LED היה אפשרות חסכונית להעריך את תפוקת הדגימות מצלחת TLC.
Introduction
כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) נמצאת בשימוש נרחב כטכניקה איכותית וכמותית בתחום הכימיה האורגנית 1,2,3. היתרונות העיקריים של TLC הם שהיא מספקת זיהוי מהיר, דרישות מדגם גמישות, ואינה דורשת ציוד מיוחד4. עד כה, למרות שגישות מתקדמות רבות הוקמו, TLC היא עדיין השיטה העיקרית לזיהוי דגימות לא ידועות בתערובת. עם זאת, האתגר של גישה זו הוא היעדר ציוד בטוח וזול לכימות תפוקת הדגימה, במיוחד לפיתוח מעבדות עם תקציבים מוגבלים. המחקר הנוכחי, אם כן, נועד לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה בשילוב עם TLC כדי להעריך את התשואה של הדגימות.
שלא כמו TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיית גז (GC) עם דרישות דגימה מחמירות, זמן רב ומעורבות של multistep להכנת דגימה 1,5, TLC הראה מספר יתרונות. ראשית, לצורך הכנת הדגימה, HPLC ו- GC אינם יכולים לזהות את התמצית הגולמית מכיוון שהתמצית הגולמית עשויה לחבר את העמודה של HPLC ו- GC. שנית, כאשר הדגימות אינן מתאימות ל- UV (חשוב לניתוח HPLC) או עם תנודתיות נמוכה (חשוב לניתוח GC), ניתן להחיל TLC על דגימות אלה, והשימוש במגיב הדמיה הופך את הדגימות המבודדות לגלויות על שכבות דקות 6,7,8. שלישית, עבור משתמשים כלליים, HPLC ו- GC דורשים בדרך כלל זמן רב יחסית לפני שהם עובדים באופן עצמאי, בהשוואה ל- TLC. בנוסף, ניתוח TLC כמותי, המכונה TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), יכול להפוך את המידע על לוח TLC לדיגיטלי באמצעות סורק רגיש במיוחד. עם זאת, העלות של מערכת HPTLC הוא יקר יחסית. ככזה, פיתוח גישה חסכונית ומהירה לכימות דגימות על צלחת TLC הוא נושא חשוב.
שיטות דומות פותחו לכימות תפוקת TLC; לדוגמה, Johnson9 דיווח על טכניקה המאפשרת לכמת את הדגימות על צלחת TLC באמצעות סורק שטוח המחובר למחשב. בשנת 2001, El-Gindy et al.10 פיתחו את השיטה TLC- densitometric, אשר שימשה לאיתור התרכובת עם צפיפות אופטית, והטכניקה יושמה גם על ידי Elkady et al.11. בשנת 2007, הס2 הציג את שיטת ה-TELC (DE-TLC) המשופרת דיגיטלית המיושמת כדי לזהות את התפוקה של תרכובת על צלחת TLC באמצעות מצלמה דיגיטלית בשילוב עם אור UV. הס גם השווה את הבדלי העלויות בין שיטת HPTLC לשיטת DE-TLC והגיע למסקנה כי ניתן להשתמש בשיטת DE-TLC במעבדות תיכון ומכללות בגלל עלותה הזולה2. עם זאת, העלות של שיטת TLC-densitometric עדיין הייתה יקרה, והפעלת אור אולטרה סגול דורשת הכשרה מקדימה מספקת למקרה שהמשתמשים עלולים להיחשף לקרינה אולטרה סגולה. לכן, בהתאם ל- TLC, רצוי לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה לכימות תפוקת המדגם.
המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול לגילוי הדגימה על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה, ופיתח מודל רגרסיה עם אמינות גבוהה (ערך ריבועי R גבוה) כדי למדוד את מידות הפסים ולאחר מכן לקבוע את התפוקה המורכבת. לבסוף, נמצא כי שיטת התאורה blue-LED היא בטוחה יחסית (לעומת שיטת גילוי UV), זולה (לעומת. GC, HPLC ו-HPTLC), וגישה יעילה (לעומת שיטת bioassay) לכימות תשואה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי תיאר גישה חדשה, תאורת ה-LED הכחולה, לכמת תרכובות ללא שימוש בציוד יקר ומתמחה, כגון שיטת HPTLC, HPLC ו-GC, והשיטה הושוותה לשיטות הביו-אסאי וה-UV שזוהו כדי להעריך את ביצועי הכימות. כתוצאה מכך, הוסק כי שיטת התאורה הכחולה-LED היא פרוטוקול בטוח ויעיל יחסית המשמש לכימות התפוקה של תרכובות ממוקדות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography – Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen, ., Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography – Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
