Summary
Il presente protocollo ha sviluppato un metodo per stimare la resa dei composti sulla piastra TLC utilizzando la tecnica di illuminazione blu-LED. I vantaggi di questo approccio sono che è sicuro, efficace, economico e consente al ricercatore di misurare più campioni contemporaneamente.
Abstract
La cromatografia su strato sottile (TLC) è una tecnica analitica accessibile che è stata ampiamente utilizzata nella ricerca di chimica organica per quantificare la resa di campioni sconosciuti. Il presente studio ha sviluppato un metodo efficace, economico e sicuro per stimare la resa dei campioni su una piastra TLC utilizzando l'illuminatore blu-LED. La lovastatina estratta da Aspergillus terreus è stato il composto di esempio utilizzato nel presente studio. Sono stati utilizzati modelli di regressione basati sullo standard di lovastatina per valutare la resa di lovastatina. Sono stati confrontati tre metodi: biotest, rilevamento UV e illuminazione blu-LED. Il risultato ha mostrato che il metodo di illuminazione blu-LED è significativamente più efficace in termini di tempo rispetto ai metodi di rilevamento UV e di bioanalisi. Inoltre, l'illuminazione blu-LED era un'opzione relativamente sicura a causa della preoccupazione dei rischi biologici nel metodo di bioanalisi (ad esempio, infezione microbica) e dell'esposizione ai raggi ultravioletti nel metodo di rilevamento UV. Rispetto ai metodi costosi che richiedono strumenti specializzati e formazione a lungo termine prima di lavorare in modo indipendente, come GC, HPLC e HPTLC, l'utilizzo dell'illuminatore blu-LED era un'opzione economica per stimare la resa dei campioni da una piastra TLC.
Introduction
La cromatografia su strato sottile (TLC) è ampiamente utilizzata come tecnica qualitativa e quantitativa nel campo della chimica organica 1,2,3. I principali vantaggi di TLC sono che fornisce un rilevamento rapido, requisiti di campionamento flessibili e non richiede attrezzature specializzate4. Ad oggi, anche se sono stati stabiliti molti approcci avanzati, TLC è ancora il metodo principale per identificare campioni sconosciuti in una miscela. Tuttavia, la sfida di questo approccio è la mancanza di attrezzature sicure e poco costose per quantificare la resa del campione, in particolare per lo sviluppo di laboratori con budget limitati. Il presente studio, quindi, mirava a sviluppare un metodo efficiente, sicuro ed economico combinato con TLC per stimare la resa dei campioni.
A differenza della TLC ad alte prestazioni (HPTLC), della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e della gascromatografia (GC) con requisiti rigorosi di campionamento, dispendiosi in termini di tempo e coinvolgimento di multistep per la preparazione del campione1,5, TLC ha mostrato diversi vantaggi. In primo luogo, per la preparazione del campione, l'HPLC e il GC non sono in grado di rilevare l'estratto grezzo perché l'estratto grezzo può ostruire la colonna di HPLC e GC. In secondo luogo, quando i campioni non sono adatti ai raggi UV (importante per l'analisi HPLC) o con bassa volatilità (importante per l'analisi GC), TLC può essere applicato a questi campioni e l'uso del reagente di visualizzazione rende i campioni isolati visibili su strati sottili 6,7,8. In terzo luogo, per gli utenti generici, HPLC e GC richiedono generalmente un tempo relativamente lungo di pre-formazione prima di lavorare in modo indipendente, rispetto a TLC. Inoltre, l'analisi quantitativa TLC, nota come TLC ad alte prestazioni (HPTLC), può digitalizzare le informazioni su una piastra TLC con uno scanner altamente sensibile. Tuttavia, il costo del sistema HPTLC è relativamente costoso. Pertanto, lo sviluppo di un approccio economico e rapido per quantificare i campioni sulla piastra TLC è un argomento importante.
Metodi simili sono stati sviluppati per la quantificazione della resa TLC; ad esempio, Johnson9 ha riportato una tecnica che consente la quantificazione dei campioni su una piastra TLC utilizzando uno scanner piano collegato a un computer. Nel 2001, El-Gindy et al.10 hanno sviluppato il metodo TLC-densitometrico, che è stato utilizzato per rilevare il composto con densità ottica, e la tecnica è stata applicata anche da Elkady et al.11. Nel 2007, Hess2 ha presentato il metodo digitally enhanced-TLC (DE-TLC) applicato per rilevare la resa di un composto su una piastra TLC utilizzando una fotocamera digitale combinata con luce UV. Hess ha anche confrontato le differenze di costo tra HPTLC e metodo DE-TLC e ha concluso che il metodo DE-TLC potrebbe essere utilizzato nei laboratori delle scuole superiori e universitari a causa del suo costo accessibile2. Tuttavia, il costo del metodo TLC-densitometrico era ancora costoso e il funzionamento della luce ultravioletta richiede un'adeguata pre-formazione nel caso in cui gli utenti potessero essere esposti alle radiazioni ultraviolette. Pertanto, compatibilmente con TLC, è auspicabile lo sviluppo di un metodo efficiente, sicuro ed economico per quantificare la resa del campione.
Il presente studio ha descritto un protocollo per rilevare il campione su una piastra TLC utilizzando l'illuminatore blu-LED e ha sviluppato un modello di regressione ad alta affidabilità (alto valore R-quadrato) per misurare le dimensioni delle bande e quindi determinare la resa del composto. Infine, è stato riscontrato che il metodo di illuminazione blu-LED è relativamente sicuro (vs. Metodo di rilevamento UV), economico (vs. GC, HPLC e HPTLC) e approccio efficace (rispetto al metodo di saggio biologico) per la quantificazione della resa.
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Protocol
Il presente protocollo è descritto usando la lovastatina come esempio. La lovastatina è stata estratta da Aspergillus terreus di una settimana.
1. Estrazione del composto
NOTA: Per i dettagli sull'estrazione dei composti, vedere la Figura 1.
- Coltura Aspergillus terreus su agar destrosio di patate (PDA; vedi tabella dei materiali) terreno a 30 °C.
- Asciugare la coltura a 40 °C per 24 ore. Trasferire la coltura essiccata in una provetta da 50 ml utilizzando una pinzetta sterilizzata e aggiungere 15 ml di acetato di etile.
- Agitare vigorosamente la miscela a vortice per 1 minuto e incubare per 1 ora a 40 °C agitando a 200 giri/min.
- Sonicare la miscela utilizzando un bagno ad ultrasuoni a 40 kHz (vedi Tabella dei materiali) a 40 °C per 1 ora.
- Centrifugare la miscela a 5.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente e filtrare attraverso una carta da filtro da 11 μm.
- Estrarre il filtrato con un volume uguale di acqua sterile in un imbuto separatore.
- Dopo la separazione di fase, raccogliere lo strato organico e quindi evaporare in un evaporatore rotante (vedere Tabella dei materiali). Sciogliere il residuo in 2 ml di acetato di etile.
2. Separazione dell'estratto grezzo mediante colonna di adsorbimento in fase normale (NP)
- Impacchettare la colonna con gel di silice NP come fase stazionaria e utilizzare n-esano:acetato di etile:acido trifluoroacetico (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) come fase mobile.
- Caricare 2 mL dell'estratto (fase 1) sulla colonna e aggiungere il solvente in fase mobile ad una portata di 1 mL/min per eluire l'estratto.
NOTA: La portata è stata controllata manualmente utilizzando un rubinetto. - Verificare l'effluente mediante TLC per confermare la presenza di lovastatina, quindi evaporare in un evaporatore rotante a 45 °C fino a quando il solvente non viene rimosso. Questo passaggio richiede circa 20-25 minuti.
- Sciogliere il residuo in 1 ml di acetato di etile e quindi mescolare con un volume uguale di acido trifluoroacetico all'1%.
- Centrifugare la miscela a 5.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente e raccogliere lo strato organico in un nuovo tubo di vetro.
3. Preparazione e caricamento di lastre per cromatogramma su strato sottile (TLC)
- Puntare 5 μL di campioni e standard di lovastatina (vedere Tabella dei materiali) sulla linea di base della piastra TLC utilizzando una pipetta capillare, lasciando un bordo di 1 cm sui lati della piastra TLC.
- Asciugare la piastra TLC in una cappa aspirante per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare delicatamente la piastra mediante una pinza in una camera di vetro satura contenente il solvente di fase mobile. Coprire la camera con un coperchio di vetro e lasciare che la piastra si sviluppi completamente.
- Rimuovere la piastra dalla camera quando la linea del solvente raggiunge 1 cm dalla parte superiore della piastra.
4. Analisi mediante illuminatore blu-LED
- Segna la linea del solvente con una matita. Asciugare la piastra nella cappa aspirante per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'essiccazione, immergere immediatamente la piastra in solvente 10% H2SO4 , quindi asciugare nella cappa aspirante per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra sul pannello riscaldante fino a quando non compaiono le macchie marroni. Assicurarsi che la piastra non sia surriscaldata, poiché ciò potrebbe rendere difficile la visualizzazione della lovastatina.
- Trasferire la piastra sull'illuminatore blu-LED e scansionarla utilizzando un freeware compatibile (MiBio Fluo) (vedi Tabella dei materiali).
5. Stima della resa mediante il modello di regressione
- Misurare la dimensione delle bande utilizzando il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali).
- Stabilire un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici (vedere Tabella dei materiali) basato sulle concentrazioni decrescenti degli standard di lovastatina, tra cui 1 mg / ml, 0,75 mg / ml, 0,5 mg / ml e 0,25 mg / ml.
- Applicare il modello di regressione per stimare la resa dei campioni.
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Representative Results
Questo studio ha presentato il metodo di illuminazione blu-LED per stimare la resa dei composti, e questo metodo è stato convalidato e confrontato con i metodi di bioanalisi e rilevati UV (Tabella 1). I modelli di regressione sono stati sviluppati sulla base delle dimensioni delle bande e della concentrazione degli standard per tre metodi, rispettivamente, per prevedere la resa dei campioni. In primo luogo, nei risultati del metodo di bioanalisi, il quadrato R tra le dimensioni della zona di inibizione e gli standard di lovastatina era 0,99 e la resa del campione era di 0,56 mg prevista dal modello di regressione (Figura 2). In secondo luogo, nel metodo di rilevamento UV, il quadrato R tra gli standard di lovastatina e la dimensione delle bande sulla piastra TLC era 0,97 e la resa del campione prevista dal modello di regressione era di 0,53 mg (Figura 3). In particolare, i bordi della banda erano sfocati e sono state osservate bande di intensità del segnale relativamente basse (Figura 3A). In terzo luogo, nel metodo di illuminazione blu-LED, il quadrato R tra gli standard di lovastatina e la dimensione delle bande sulla piastra TLC era 0,98 e la resa del campione era di 0,54 mg prevista dal modello di regressione (Figura 4). La resa prevista utilizzando l'illuminatore blu-LED era più vicina al metodo di bioanalisi (impostato come controllo). La dimensione della banda era proporzionale alla quantità di lovastatina e le bande trasparenti erano ottenute con il metodo di illuminazione blu-LED. Inoltre, le ore di lavoro del biotest, dei metodi di illuminazione UV-detected e blue-LED erano rispettivamente di circa 24 ore, 2 ore e 1 ora; (Nota: per orario di lavoro si intende il tempo totale dedicato all'esame della resa della lovastatina).
Figura 1: Il flusso di lavoro del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Metodo di saggio biologico. (A) Biodosaggio della lovastatina contro Neurospora crassa (incubato per 24 ore a 30 °C). Alla fine del processo, le lastre di agar da 90 mm sono state fotografate sotto la luce visibile. (B) Le concentrazioni di sei standard di lovastatina erano: n. 1 (1 mg / ml), n. 2 (0,75 mg / ml), n. 3 (0,5 mg / ml) e n. 4 (0,25 mg / ml). Il campione n. 5 è stato diluito a 0,25× (1:4). Il campione n. 6 è stato diluito a 0,5× (1:2). La dimensione della zona di inibizione (mm2) è stata misurata dal software di imaging. (C) È stato sviluppato un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici basato sulla dimensione della zona di inibizione degli standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Piastra per cromatogramma a strato sottile (TLC) esposta alla luce UV. (A) L'acetato di n-esano:etile (2:3 v/v) è stato utilizzato come fase mobile nell'analisi TLC e la piastra TLC è stata esposta alla luce UV (365 nm) dopo l'immersione nello sviluppatore (10% H2SO4). (B) Le concentrazioni di sei standard di lovastatina erano: n. 1 (1 mg / ml), n. 2 (0,75 mg / ml), n. 3 (0,5 mg / ml) e n. 4 (0,25 mg / ml). Il campione n. 5 è stato diluito a 0,25× (1:4). Il campione n. 6 è stato diluito a 0,5× (1:2). La dimensione della zona di inibizione (mm2) è stata misurata dal software di imaging. (C) È stato sviluppato un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici basato sulla dimensione delle bande standard di lovastatina sulla piastra TLC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Lastra di cromatogramma a strato sottile (TLC) scansionata dall'illuminatore a LED blu. (A) L'acetato di n-esano:etile (2:3 v/v) è stato utilizzato come fase mobile nell'analisi TLC e la piastra TLC è stata scansionata dall'illuminatore blu-LED. (B) Le concentrazioni di sei standard di lovastatina erano: n. 1 (1 mg / ml), n. 2 (0,75 mg / ml), n. 3 (0,5 mg / ml) e n. 4 (0,25 mg / ml). Il campione n. 5 è stato diluito a 0,25× (1:4). Il campione n. 6 è stato diluito a 0,5× (1:2). La dimensione della zona di inibizione (mm2) è stata misurata dal software di imaging. (C) È stato sviluppato un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici basato sulla dimensione delle bande standard di lovastatina sulla piastra TLC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Saggio biologico | Illuminatore blu-LED | Rilevato dai raggi UV | |
| Osservazione dei risultati | Occhi | Illuminatore e occhi blu-LED | Luce UV e occhi |
| Risoluzione dell'immagine | Medio | Alto | Basso (immagine sfocata e debole) |
| Costo temporale approssimativo | 24 ore su 24 | 1 h | 2 ore |
| Abilità di analisi richieste | Medio | Basso | Medio |
| Sicurezza | Infezione microbica | Molto sicuro | Esposizione ai raggi UV |
| Equazione di regressione | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
| R-quadrato | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| Pendio | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| Intercettare | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| Errore standard di pendenza | 8,94E-05 | 3,54E-03 | 6,28E-03 |
| Errore standard di intercettazione | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Tabella 1: Confronto dei tre metodi di rilevazione utilizzati in questo studio.
| Metodo TLC-densitometrico | Analisi delle immagini TLC | |||||||
| El-Gindy et al.10 |
Elkady · et al.11 |
Musharraf et al.12 |
Johnson9 | Hess2 | Metodo Blue-LED Illuminator (Questo studio) |
|||
| Campione | Acebutololo HCL | Ciprofloxacina HCL | Metronidazole | Danazolo | Colesterolo | Vanillina | Nicotinammide | Lovastatina |
| Risultati | UV rivelatore |
Cure amorevoli scanner |
Cure amorevoli scanner |
Scanner piano | Macchina fotografica digitale con lampada UV |
Illuminatore blu-LED | ||
| Lunghezza d’onda | 230 nm | 280 nm | 280 nm | 291 nm | NA | 254 nm | NA | |
| Coefficiente di correlazione | 0,996a | 0,9991a | 0,9994a | 0,996a | 0,998a | 0,971b | 0,987b | 0,99A 0,98b |
| Equazione di regressione | NA | y = 5,7853x +19.9383 |
y = 1,1104x + 6.9755 |
y = 7,949x + 2460 | y = 0,96x | NA | NA | y = 0,0399x -0.1271 |
| a: Coefficiente di correlazione di Pearson | ||||||||
| b: R-quadrato | ||||||||
Tabella 2: Confronto tra i metodi precedenti e lo studio attuale.
Figura supplementare 1: La piastra di cromatogramma a strato sottile (TLC) con ampicillina è stata scansionata con il metodo di illuminazione blu-LED. (A) Acetato di etile:metanolo (9:13 v/v) è stato utilizzato come fase mobile nell'analisi TLC e la piastra TLC è stata scansionata dall'illuminatore blu-LED. (B) La concentrazione di quattro standard di ampicillina era: n. 1 (100 mg / ml), n. 2 (75 mg / ml), n. 3 (50 mg / ml) e n. 4 (25 mg / ml). La dimensione delle bande è stata misurata dal software di imaging. (C) È stato sviluppato un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici basato sulla dimensione delle bande standard di ampicillina sulla piastra TLC. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Piastra per cromatogramma a strato sottile (TLC) con apramicina scansionata con il metodo di illuminazione blu-LED. (A) Metanolo:acqua (6:5 v/v) è stata utilizzata come fase mobile nell'analisi TLC e la piastra TLC è stata scansionata dall'illuminatore blu-LED. (B) La concentrazione di quattro standard di apramicina era: n. 1 (50 mg / ml), n. 2 (40 mg / ml), n. 3 (30 mg / ml) e n. 4 (20 mg / ml). La dimensione delle bande è stata misurata dal software di imaging. (C) È stato sviluppato un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici basato sulla dimensione delle bande standard di apramicina sulla piastra TLC. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il presente studio ha descritto un nuovo approccio, l'illuminatore blu-LED, per quantificare i composti senza utilizzare apparecchiature costose e specializzate, come HPTLC, HPLC e metodo GC, e il metodo è stato confrontato con il saggio biologico e i metodi rilevati dai raggi UV per valutare le prestazioni di quantificazione. Di conseguenza, si è concluso che il metodo di illuminazione blu-LED è un protocollo relativamente sicuro ed efficace utilizzato per quantificare la resa di composti mirati sulla piastra TLC.
Studi precedenti hanno riportato diversi metodi quantitativi senza l'uso di attrezzature quantitative specializzate, e tutti gli studi hanno dimostrato che l'accuratezza della quantificazione era vicina a quella dell'uso di attrezzature specializzate 2,9,10,11,12 (Tabella 2). Ad esempio, El-Gindy et al.10 hanno confrontato l'accuratezza della resa stimata sulla base dei metodi HPLC e TLC-densitometrici e i risultati hanno mostrato che non vi erano differenze significative tra i due metodi (valore p < 0,05). Rispetto al metodo di illuminazione blu-LED in questo studio, il metodo TLC-densitometrico sviluppato da El-Gindy et al.10 richiedeva uno speciale rivelatore di lunghezze d'onda, mentre il metodo di illuminazione blu-LED richiedeva uno scanner blu-LED semplice ed economico. Nel frattempo, lo scanner blu-LED potrebbe essere utilizzato anche per altri scopi, come la scansione elettroforesi su gel, ma lo scanner TLC specializzato sviluppato da Elkady et al.11 è stato utilizzato solo per il metodo TLC-densitometrico.
Oltre al metodo TLC-densitometrico10,11, sono stati sviluppati lo scanner piano e il metodo della fotocamera digitale per rilevare la resa dei campioni. Ad esempio, Johnson9 ha stabilito un metodo di rilevamento TLC rapido utilizzando lo scanner piano e quindi ha misurato l'assorbimento utilizzando un software di immagine commerciale. Tuttavia, il software di immagine utilizzato nel metodo di illuminazione blu-LED era gratuito e facile da usare. Hess2 ha sviluppato il software "TLC analyzer" per stimare la dimensione delle bande sulle immagini delle lastre TLC scattate da una fotocamera digitale, che era simile al metodo rilevato dai raggi UV in questo studio. Tuttavia, entrambi i metodi possono interagire potenzialmente con i pericoli della luce UV.
I modelli di regressione basati sulla dimensione delle bande standard sono stati sviluppati per il bioassay, l'illuminatore blu-LED e il metodo rilevato UV, e il valore R-quadrato era rispettivamente 0,99, 0,98 e 0,97 (Tabella 1). Poiché è stata raggiunta un'elevata linearità (R-quadrato), si suggerisce che il modello di regressione potrebbe misurare la resa dei campioni. Il valore X nel modello di regressione è stato sostituito dalla dimensione delle bande degli standard e la resa stimata (valore Y previsto nel modello di regressione) era di circa 5,6, 5,4 e 5,3, determinata rispettivamente da metodi di rilevamento bioassay, blue-LED e UV. I risultati hanno indicato che il quadrato R e la resa stimata utilizzando l'illuminatore blu-LED erano più vicini al metodo di bioanalisi (impostato come controllo) rispetto al metodo rilevato UV (Tabella 1).
Per comprendere i limiti di questo approccio, l'approccio è stato applicato anche per rilevare altri due composti, tra cui ampicillina e apramicina; i risultati sono mostrati nella figura supplementare 1 e nella figura supplementare 2. Due passaggi importanti devono essere notati in questo approccio: (1) dopo l'essiccazione, la lastra deve essere visualizzata immediatamente; la visualizzazione ritardata può influire sul rilevamento spot; (2) La sovraesposizione della lastra non è raccomandata in quanto l'immagine acquisita dalla lastra viene fornita con uno sfondo elevato e rende difficile misurare le aree delle macchie.
Per concludere, il metodo di illuminazione blu-LED è un approccio relativamente sicuro, che consente di risparmiare tempo, economico e meno laborioso per accelerare la quantificazione della resa dei campioni rispetto ad altri metodi cromatografici quantitativi; Pertanto, questo approccio è un protocollo ideale per l'uso nello sviluppo di laboratori con budget limitati. Nel frattempo, le immagini della piastra TLC recuperate dal metodo di illuminazione blu-LED erano molto più chiare di quelle del metodo di rilevamento UV (Figura 3A vs. Figura 4A), che ha anche aiutato a determinare con precisione la dimensione delle bande sulla piastra TLC e anche a stimare la resa dei campioni.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
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