Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल ने नीली-एलईडी रोशनी तकनीक का उपयोग करके टीएलसी प्लेट पर यौगिकों की उपज का अनुमान लगाने के लिए एक विधि विकसित की। इस दृष्टिकोण के फायदे यह हैं कि यह सुरक्षित, प्रभावी, सस्ती है, और शोधकर्ता को एक साथ कई नमूनों को मापने की अनुमति देता है।
Abstract
पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) एक सुलभ विश्लेषणात्मक तकनीक है जिसका उपयोग अज्ञात नमूनों की उपज को निर्धारित करने के लिए कार्बनिक रसायन विज्ञान अनुसंधान में बड़े पैमाने पर किया गया है। वर्तमान अध्ययन ने ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का उपयोग करके टीएलसी प्लेट पर नमूनों की उपज का अनुमान लगाने के लिए एक प्रभावी, सस्ता और सुरक्षित तरीका विकसित किया। एस्परगिलस टेरियस से निकाला गया लवस्टैटिन वर्तमान अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला उदाहरण यौगिक था। लवस्टैटिन मानक पर आधारित प्रतिगमन मॉडल का उपयोग लवस्टैटिन की उपज का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। तीन तरीकों की तुलना की गई: बायोसेसे, यूवी डिटेक्शन और ब्लू-एलईडी रोशनी। परिणाम से पता चला कि ब्लू-एलईडी रोशनी विधि यूवी का पता लगाने और बायोसेसे विधियों की तुलना में काफी अधिक समय प्रभावी है। इसके अतिरिक्त, बायोसेसे विधि (जैसे, माइक्रोबियल संक्रमण) में जैविक खतरों और यूवी पहचान विधि में पराबैंगनी जोखिम की चिंता के कारण ब्लू-एलईडी रोशनी अपेक्षाकृत सुरक्षित विकल्प था। जीसी, एचपीएलसी और एचपीटीएलसी जैसे स्वतंत्र रूप से काम करने से पहले विशेष उपकरणों और दीर्घकालिक प्रशिक्षण की आवश्यकता वाले महंगे तरीकों की तुलना में, ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का उपयोग करना टीएलसी प्लेट से नमूनों की उपज का अनुमान लगाने के लिए एक किफायती विकल्प था।
Introduction
पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) का व्यापक रूप से कार्बनिक रसायन विज्ञान 1,2,3 के क्षेत्र में गुणात्मक और मात्रात्मक तकनीक के रूप में उपयोग किया जाता है। टीएलसी के मुख्य लाभ यह हैं कि यह तेजी से पहचान, लचीली नमूना आवश्यकताओं को प्रदान करता है, और विशेष उपकरण4 की आवश्यकता नहीं होती है। आज तक, भले ही कई उन्नत दृष्टिकोण स्थापित किए गए हैं, टीएलसी अभी भी मिश्रण में अज्ञात नमूनों की पहचान करने का मुख्य तरीका है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की चुनौती नमूना उपज को निर्धारित करने के लिए सुरक्षित और सस्ती उपकरणों की कमी है, खासकर सीमित बजट के साथ प्रयोगशालाओं के विकास के लिए। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य नमूनों की उपज का अनुमान लगाने के लिए टीएलसी के साथ संयोजन करने वाली एक कुशल, सुरक्षित और सस्ती विधि विकसित करना है।
उच्च प्रदर्शन वाले टीएलसी (एचपीटीएलसी), उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), और गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) के विपरीत सख्त नमूना आवश्यकताओं, समय लेने वाली और नमूना तैयार करने के लिए मल्टीस्टेप की भागीदारी 1,5 के साथ, टीएलसी ने कई फायदे दिखाए। सबसे पहले, नमूना तैयार करने के लिए, एचपीएलसी और जीसी कच्चे अर्क का पता नहीं लगा सकते हैं क्योंकि क्रूड एक्सट्रैक्ट एचपीएलसी और जीसी के कॉलम को प्लग कर सकता है। दूसरा, जब नमूने यूवी-उपयुक्त नहीं होते हैं (एचपीएलसी विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण) या कम अस्थिरता (जीसी विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण) के साथ, टीएलसी को इन नमूनों पर लागू किया जा सकता है, और विज़ुअलाइज़ेशन अभिकर्मक का उपयोग पृथक नमूनों को पतली परतों 6,7,8 पर दिखाई देता है। तीसरा, सामान्य उपयोगकर्ताओं के लिए, एचपीएलसी और जीसी को आम तौर पर टीएलसी की तुलना में स्वतंत्र रूप से काम करने से पहले अपेक्षाकृत लंबे समय तक पूर्व-प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, मात्रात्मक टीएलसी विश्लेषण, जिसे उच्च प्रदर्शन टीएलसी (एचपीटीएलसी) के रूप में जाना जाता है, अत्यधिक संवेदनशील स्कैनर के साथ टीएलसी प्लेट पर जानकारी को डिजिटाइज़ कर सकता है। हालांकि, एचपीटीएलसी प्रणाली की लागत अपेक्षाकृत महंगी है। जैसे, टीएलसी प्लेट पर नमूनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक लागत प्रभावी और तेज़ दृष्टिकोण विकसित करना एक महत्वपूर्ण विषय है।
टीएलसी उपज परिमाणीकरण के लिए इसी तरह के तरीके विकसित किए गए हैं; उदाहरण के लिए, जॉनसन9 ने एक तकनीक की सूचना दी जो कंप्यूटर से जुड़े फ्लैटबेड स्कैनर का उपयोग करके टीएलसी प्लेट पर नमूनों की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है। 2001 में, एल-गिंडी एट अल.10 ने टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधि विकसित की, जिसका उपयोग ऑप्टिकल घनत्व के साथ यौगिक का पता लगाने के लिए किया गया था, और तकनीक को एल्काडी एट अल.11 द्वारा भी लागू किया गया था। 2007 में, हेस2 ने यूवी प्रकाश के साथ संयुक्त डिजिटल कैमरे का उपयोग करके टीएलसी प्लेट पर एक यौगिक की उपज का पता लगाने के लिए लागू डिजिटल रूप से एन्हांस्ड-टीएलसी (डीई-टीएलसी) विधि प्रस्तुत की। हेस ने एचपीटीएलसी और डीई-टीएलसी विधि के बीच लागत अंतर की भी तुलना की और निष्कर्ष निकाला कि डीई-टीएलसी विधि का उपयोग हाई स्कूल और कॉलेज प्रयोगशालाओं में इसकी सस्ती लागत2 के कारण किया जा सकता है। हालांकि, टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधि की लागत अभी भी महंगी थी, और पराबैंगनी प्रकाश के संचालन के लिए पर्याप्त पूर्व-प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है यदि उपयोगकर्ता पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में आ सकते हैं। इसलिए, टीएलसी के साथ संगत, नमूना उपज को निर्धारित करने के लिए एक कुशल, सुरक्षित और सस्ती विधि विकसित करना वांछनीय है।
वर्तमान अध्ययन ने ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का उपयोग करके टीएलसी प्लेट पर नमूने का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया, और बैंड के आयामों को मापने के लिए उच्च विश्वसनीयता (उच्च आर-वर्ग मूल्य) के साथ एक प्रतिगमन मॉडल विकसित किया, और फिर यौगिक उपज निर्धारित की। अंत में, यह पाया गया कि नीली-एलईडी रोशनी विधि अपेक्षाकृत सुरक्षित है (बनाम। यूवी-डिटेक्शन विधि, सस्ता (बनाम। जीसी, एचपीएलसी, और एचपीटीएलसी, और उपज परिमाणीकरण के लिए प्रभावी (बनाम बायोएसे विधि) दृष्टिकोण।
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Protocol
वर्तमान प्रोटोकॉल को एक उदाहरण के रूप में लवस्टैटिन का उपयोग करके वर्णित किया गया है। लवस्टैटिन को एक सप्ताह के एस्परगिलस टेरियस से निकाला गया था।
1. यौगिक निष्कर्षण
नोट: यौगिक निष्कर्षण पर विवरण के लिए, कृपया चित्रा 1 देखें।
- 30 डिग्री सेल्सियस पर आलू डेक्सट्रोज एगर (पीडीए, सामग्री की तालिका देखें) माध्यम पर एस्परगिलस टेरियस।
- 24 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को सुखाएं। स्टरलाइज़्ड ट्वीज़र्स का उपयोग करके सूखे कल्चर को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 15 एमएल एथिल एसीटेट जोड़ें।
- मिश्रण को 1 मिनट के लिए भंवर द्वारा जोर से हिलाएं और 200 आरपीएम पर झटकों के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- 1 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 40 kHz अल्ट्रासोनिक स्नान ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मिश्रण को सोनिकेट करें।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 5,000 x g पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें और 11 μm फ़िल्टर पेपर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
- एक अलग फ़नल में बाँझ पानी की समान मात्रा के साथ छानना निकालें।
- चरण पृथक्करण के बाद, कार्बनिक परत एकत्र करें, और फिर एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता में वाष्पित हो जाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। अवशेषों को 2 एमएल एथिल एसीटेट में घोलें।
2. सामान्य चरण (एनपी) सोखना कॉलम द्वारा कच्चे अर्क का पृथक्करण
- स्थिर चरण के रूप में एनपी सिलिका जेल के साथ कॉलम पैक करें, और मोबाइल चरण के रूप में एन-हेक्सेन: एथिल एसीटेट: ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (एच: ई: टी; 80: 20: 0.1, वी / वी / वी) का उपयोग करें।
- एक्सट्रैक्ट के 2 एमएल (चरण 1) को कॉलम पर लोड करें और अर्क को हटाने के लिए 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर मोबाइल चरण विलायक जोड़ें।
नोट: प्रवाह दर को स्टॉपकॉक का उपयोग करके मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया गया था। - लवस्टैटिन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए टीएलसी द्वारा बहिःस्राव को सत्यापित करें, और फिर 45 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी बाष्पीकरणकर्ता में वाष्पित हो जाएं जब तक कि विलायक को हटा नहीं दिया जाता। इस चरण में लगभग 20-25 मिनट लगते हैं।
- अवशेषों को एथिल एसीटेट के 1 एमएल में घोलें, और फिर 1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड की समान मात्रा के साथ मिलाएं।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 5,000 x g पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें और एक नई ग्लास ट्यूब में कार्बनिक परत एकत्र करें।
3. पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) प्लेटों की तैयारी और लोडिंग
- केशिका पिपेट का उपयोग करके टीएलसी प्लेट की बेसलाइन पर नमूने और लवस्टैटिन मानकों ( सामग्री की तालिका देखें) का स्पॉट 5 μL, टीएलसी प्लेट के किनारों पर 1 सेमी की सीमा छोड़ता है।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए टीएलसी प्लेट को फ्यूम हुड में सुखाएं।
- मोबाइल चरण विलायक युक्त संतृप्त ग्लास कक्ष में बल द्वारा प्लेट को धीरे से रखें। कक्ष को कांच के ढक्कन से कवर करें और प्लेट को पूरी तरह से विकसित होने दें।
- जब विलायक रेखा प्लेट के शीर्ष से 1 सेमी तक पहुंच जाती है तो प्लेट को कक्ष से हटा दें।
4. ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर द्वारा विश्लेषण
- एक पेंसिल के साथ विलायक रेखा को चिह्नित करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फ्यूम हुड में प्लेट को सुखाएं।
- सूखने के बाद, तुरंत प्लेट को 10% एच2एसओ4 विलायक में भिगोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फ्यूम हुड में सुखाएं।
- प्लेट को हीटिंग पैनल पर रखें जब तक कि भूरे रंग के धब्बे दिखाई न दें। सुनिश्चित करें कि प्लेट को अधिक गर्म नहीं किया गया है, क्योंकि इससे लवस्टैटिन का विज़ुअलाइज़ेशन मुश्किल हो सकता है।
- प्लेट को ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर में स्थानांतरित करें और एक संगत फ्रीवेयर (MiBio Fluo) का उपयोग करके स्कैन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
5. प्रतिगमन मॉडल द्वारा उपज अनुमान
- ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करबैंड के आयाम को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 1 मिलीग्राम / एमएल, 0.75 मिलीग्राम / एमएल, 0.5 मिलीग्राम / एमएल, और 0.25 मिलीग्राम / एमएल सहित लवस्टैटिन मानकों की अवरोही सांद्रता के आधार पर डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक प्रतिगमन मॉडल स्थापित करें।
- नमूने की उपज का अनुमान लगाने के लिए प्रतिगमन मॉडल लागू करें।
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Representative Results
इस अध्ययन ने यौगिकों की उपज का अनुमान लगाने के लिए ब्लू-एलईडी रोशनी विधि प्रस्तुत की, और इस विधि को मान्य किया गया और बायोसेसे और यूवी-पता लगाए गए तरीकों (तालिका 1) की तुलना की गई। नमूने की उपज की भविष्यवाणी करने के लिए, प्रतिगमन मॉडल क्रमशः तीन तरीकों के लिए बैंड के आयामों और मानकों की एकाग्रता के आधार पर विकसित किए गए थे। सबसे पहले, बायोएसे विधि के परिणामों में, निषेध क्षेत्र और लवस्टैटिन मानकों के आयामों के बीच आर-स्क्वायर 0.99 था, और प्रतिगमन मॉडल (चित्रा 2) द्वारा नमूना उपज 0.56 मिलीग्राम की भविष्यवाणी की गई थी। दूसरा, यूवी-डिटेक्शन विधि में, लोवास्टैटिन मानकों और टीएलसी प्लेट पर बैंड के आयाम के बीच आर-स्क्वायर 0.97 था, और प्रतिगमन मॉडल द्वारा अनुमानित नमूने की उपज 0.53 मिलीग्राम थी (चित्रा 3)। विशेष रूप से, बैंड के किनारे धुंधले थे, और अपेक्षाकृत कम सिग्नल तीव्रता बैंड देखे गए थे (चित्रा 3 ए)। तीसरा, ब्लू-एलईडी रोशनी विधि में, टीएलसी प्लेट पर लवस्टैटिन मानकों और बैंड के आयाम के बीच आर-स्क्वायर 0.98 था, और प्रतिगमन मॉडल (चित्रा 4) द्वारा नमूना उपज 0.54 मिलीग्राम की भविष्यवाणी की गई थी। ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का उपयोग करके अनुमानित उपज बायोसेसे विधि (नियंत्रण के रूप में सेट) के करीब थी। बैंड का आयाम लवस्टैटिन की मात्रा के समानुपाती था, और स्पष्ट बैंड ब्लू-एलईडी रोशनी विधि द्वारा प्राप्त किए गए थे। इसके अलावा, बायोसेसे, यूवी-डिटेक्ट और ब्लू-एलईडी रोशनी विधियों के काम के घंटे क्रमशः लगभग 24 घंटे, 2 घंटे और 1 घंटे थे; (नोट: काम के घंटे का मतलब है लवस्टैटिन की उपज परीक्षा पर खर्च किया गया कुल समय)।
चित्र 1: प्रोटोकॉल का कार्यशील प्रवाह. कृपया इस चित्र का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
(ए) न्यूरोस्पोरा क्रैसा के खिलाफ लवस्टैटिन का बायोसेसे (30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया)। परीक्षण के अंत में, 90 मिमी आगर प्लेटों को दृश्य प्रकाश के तहत फोटो खींचा गया था। (बी) छह लवस्टैटिन मानकों की सांद्रता थी: नंबर 1 (1 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 2 (0.75 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 3 (0.5 मिलीग्राम / एमएल), और नंबर 4 (0.25 मिलीग्राम / एमएल)। नमूना संख्या 5 को 0.25× (1: 4) तक पतला किया गया था। नमूना संख्या 6 को 0.5× (1: 2) तक पतला किया गया था। अवरोध क्षेत्र आयाम (मिमी2) इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था। (ग) मानकों के निषेध क्षेत्र आयाम के आधार पर डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक प्रतिगमन मॉडल विकसित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) प्लेट यूवी प्रकाश के संपर्क में है। (A) N-hexane: ethyl एसीटेट (2: 3 v / v) का उपयोग TLC विश्लेषण में मोबाइल चरण के रूप में किया गया था, और TLC प्लेट को डेवलपर (10% H2SO4) में भिगोने के बाद यूवी प्रकाश (365 एनएम) के संपर्क में लाया गया था। (बी) छह लवस्टैटिन मानकों की सांद्रता थी: नंबर 1 (1 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 2 (0.75 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 3 (0.5 मिलीग्राम / एमएल), और नंबर 4 (0.25 मिलीग्राम / एमएल)। नमूना संख्या 5 को 0.25× (1: 4) तक पतला किया गया था। नमूना संख्या 6 को 0.5× (1: 2) तक पतला किया गया था। अवरोध क्षेत्र आयाम (मिमी2) इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था। (सी) टीएलसी प्लेट पर लवस्टैटिन मानक बैंड के आयाम के आधार पर डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक प्रतिगमन मॉडल विकसित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: नीली-एलईडी इलुमिनेटर द्वारा स्कैन की गई पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) प्लेट। (ए) एन-हेक्सेन: एथिल एसीटेट (2: 3 वी / वी) का उपयोग टीएलसी विश्लेषण में मोबाइल चरण के रूप में किया गया था, और टीएलसी प्लेट को ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर द्वारा स्कैन किया गया था। (बी) छह लवस्टैटिन मानकों की सांद्रता थी: नंबर 1 (1 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 2 (0.75 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 3 (0.5 मिलीग्राम / एमएल), और नंबर 4 (0.25 मिलीग्राम / एमएल)। नमूना संख्या 5 को 0.25× (1: 4) तक पतला किया गया था। नमूना संख्या 6 को 0.5× (1: 2) तक पतला किया गया था। अवरोध क्षेत्र आयाम (मिमी2) इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था। (सी) टीएलसी प्लेट पर लवस्टैटिन मानक बैंड के आयाम के आधार पर डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक प्रतिगमन मॉडल विकसित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| बायोसेसे | ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर | यूवी-डिटेक्ट | |
| परिणाम अवलोकन | नेत्र | ब्लू-एलईडी प्रकाशक और आंखें | यूवी प्रकाश और आंखें |
| छवि संकल्प | मध्यम | उच्च | नीचा (धुंधली और धुंधली छवि) |
| अनुमानित समय लागत | 24 घंटे | 1 घंटे | 2 घंटे |
| विश्लेषण कौशल की आवश्यकता | मध्यम | नीचा | मध्यम |
| सुरक्षा | माइक्रोबियल संक्रमण | बहुत सुरक्षित | यूवी प्रकाश जोखिम |
| प्रतिगमन समीकरण | y = 0.0019x + 0.0304 | y = 0.0399x - 0.1271 | y = 0.0657x - 0.6405 |
| R-वर्ग | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| ढाल | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| अवरोधन | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| ढलान की मानक त्रुटि | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| इंटरसेप्ट की मानक त्रुटि | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली तीन पहचान विधियों की तुलना।
| टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधि | टीएलसी-छवि विश्लेषण | |||||||
| एल-गिंडी एट अल.10 |
Elkady एट अल.11 |
मुशर्रफ एट अल.12 |
जॉनसन9 | Hess 2 | ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर विधि (यह अध्ययन) |
|||
| नमूना | Acebutolol HCL | सिप्रोफ्लोक्सासिन एचसीएल | Metronidazole | Danazol | कोलेस्ट्रॉल | वनीलिन | निकोटिनामाइड | Lovastatin |
| परिणाम | यूवी संसूचक |
टीएलसी स्कैनर |
टीएलसी स्कैनर |
फ्लैटबेड स्कैनर | डिजिटल कैमरा यूवी लैंप के साथ |
ब्लू-एलईडी प्रकाशक | ||
| तरंग-दूरी | 230 एनएम | 280 एनएम | 280 एनएम | 291 एनएम | ना | 254 एनएम | ना | |
| सहसंबंध गुणांक | 0.996a | 0.9991a | 0.9994a | 0.996a | 0.998a | 0.971b | 0.987b | 0.99a 0.98b |
| प्रतिगमन समीकरण | ना | y = 5.7853x +19.9383 |
y = 1.1104x + 6.9755 |
y = 7.949x + 2460 | y = 0.96x | ना | ना | y = 0.0399x -0.1271 |
| ए: पियर्सन सहसंबंध गुणांक | ||||||||
| b: R-square | ||||||||
तालिका 2: पिछले तरीकों और वर्तमान अध्ययन की तुलना।
पूरक चित्रा 1: एम्पीसिलीन के साथ पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) प्लेट को नीली-एलईडी रोशनी विधि द्वारा स्कैन किया गया था। (ए) एथिल एसीटेट: मेथनॉल (9: 13 वी / वी) का उपयोग टीएलसी विश्लेषण में मोबाइल चरण के रूप में किया गया था, और टीएलसी प्लेट को ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर द्वारा स्कैन किया गया था। (बी) चार एम्पीसिलीन मानकों की सांद्रता थी: नंबर 1 (100 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 2 (75 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 3 (50 मिलीग्राम / एमएल), और नंबर 4 (25 मिलीग्राम / एमएल)। बैंड के आयाम को इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था। (सी) टीएलसी प्लेट पर एम्पीसिलीन मानक बैंड के आयाम के आधार पर डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक प्रतिगमन मॉडल विकसित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 2: नीली-एलईडी रोशनी विधि द्वारा स्कैन किए गए अप्रामाइसिन के साथ पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) प्लेट। (ए) मेथनॉल: पानी (6: 5 वी / वी) का उपयोग टीएलसी विश्लेषण में मोबाइल चरण के रूप में किया गया था और टीएलसी प्लेट को ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर द्वारा स्कैन किया गया था। (बी) चार एप्रामाइसिन मानकों की एकाग्रता थी: नंबर 1 (50 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 2 (40 मिलीग्राम / एमएल), नंबर 3 (30 मिलीग्राम / एमएल), और नंबर 4 (20 मिलीग्राम / एमएल)। बैंड के आयाम को इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था। (सी) टीएलसी प्लेट पर एप्रामाइसिन मानक बैंड के आयाम के आधार पर डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक प्रतिगमन मॉडल विकसित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वर्तमान अध्ययन ने एचपीटीएलसी, एचपीएलसी और जीसी विधि जैसे महंगे और विशेष उपकरणों का उपयोग किए बिना यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक नए दृष्टिकोण, ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का वर्णन किया, और विधि की तुलना परिमाणीकरण प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए बायोसेसे और यूवी-पता लगाए गए तरीकों के साथ की गई थी। नतीजतन, यह निष्कर्ष निकाला गया कि ब्लू-एलईडी रोशनी विधि एक अपेक्षाकृत सुरक्षित और प्रभावी प्रोटोकॉल है जिसका उपयोग टीएलसी प्लेट पर लक्षित यौगिकों की उपज को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
पिछले अध्ययनों ने विशेष मात्रात्मक उपकरणों का उपयोग किए बिना कई मात्रात्मक तरीकों की सूचना दी है, और सभी अध्ययनों से पता चला है कि मात्रा की सटीकता विशेष उपकरण 2,9,10,11,12 (तालिका 2) के उपयोग के करीब थी। उदाहरण के लिए, एल-गिंडी एट अल.10 ने एचपीएलसी और टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधियों के आधार पर अनुमानित उपज की सटीकता की तुलना की, और परिणामों से पता चला कि दोनों विधियों (पी-वैल्यू < 0.05) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे। इस अध्ययन में ब्लू-एलईडी रोशनी विधि की तुलना में, एल-गिंडी एट अल.10 द्वारा विकसित टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधि को एक विशेष तरंग दैर्ध्य डिटेक्टर की आवश्यकता थी, जबकि नीली-एलईडी रोशनी विधि को एक सरल और सस्ती नीले-एलईडी स्कैनर की आवश्यकता थी। इस बीच, ब्लू-एलईडी स्कैनर का उपयोग अन्य उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि जेल वैद्युतकणसंचलन स्कैनिंग, लेकिन एल्काडी एट अल .11 द्वारा विकसित विशेष टीएलसी स्कैनर का उपयोग केवल टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधि के लिए किया गया था।
टीएलसी-डेंसिटोमेट्रिक विधि10,11 के अलावा, नमूनों की उपज का पता लगाने के लिए फ्लैटबेड स्कैनर और डिजिटल कैमरा विधि विकसित की गई थी। उदाहरण के लिए, जॉनसन9 ने फ्लैटबेड स्कैनर का उपयोग करके एक तेजी से टीएलसी डिटेक्शन विधि स्थापित की, और फिर वाणिज्यिक छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अवशोषण को मापा। हालांकि, ब्लू-एलईडी रोशनी विधि में उपयोग किया जाने वाला छवि सॉफ्टवेयर मुफ्त और उपयोग करने में आसान था। हेस2 ने एक डिजिटल कैमरे द्वारा ली गई टीएलसी प्लेट छवियों पर बैंड के आयाम का अनुमान लगाने के लिए "टीएलसी विश्लेषक" सॉफ्टवेयर विकसित किया, जो इस अध्ययन में यूवी-पता लगाने वाली विधि के समान था। हालांकि, दोनों विधियां यूवी प्रकाश खतरों के साथ संभावित रूप से बातचीत कर सकती हैं।
मानकों के बैंड के आयाम के आधार पर प्रतिगमन मॉडल बायोएसे, ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर और यूवी-डिटेक्ट विधि के लिए विकसित किए गए थे, और आर-स्क्वायर मान क्रमशः 0.99, 0.98 और 0.97 था (तालिका 1)। जैसा कि उच्च रैखिकता (आर-स्क्वायर) हासिल की गई थी, यह सुझाव दिया जाता है कि प्रतिगमन मॉडल नमूनों की उपज को माप सकता है। प्रतिगमन मॉडल में एक्स-मान को मानकों के बैंड के आयाम द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, और अनुमानित उपज (प्रतिगमन मॉडल में अनुमानित वाई-मूल्य) क्रमशः बायोसेसे, ब्लू-एलईडी और यूवी-डिटेक्शन विधियों द्वारा निर्धारित लगभग 5.6, 5.4 और 5.3 थी। परिणामों ने संकेत दिया कि ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का उपयोग करके आर-स्क्वायर और अनुमानित उपज यूवी-पता लगाई गई विधि (तालिका 1) की तुलना में बायोएसे विधि (नियंत्रण के रूप में सेट) के करीब थी।
इस दृष्टिकोण की सीमाओं को समझने के लिए, दृष्टिकोण को एम्पीसिलीन और एप्रामाइसिन सहित दो अन्य यौगिकों का पता लगाने के लिए भी लागू किया गया था; परिणाम पूरक चित्र 1 और पूरक चित्र 2 में दिखाए गए हैं। इस दृष्टिकोण में दो महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान दिया जाना चाहिए: (1) सूखने के बाद, प्लेट को तुरंत कल्पना की जानी चाहिए; विलंबित विज़ुअलाइज़ेशन स्पॉट डिटेक्शन को प्रभावित कर सकता है; (2) प्लेट के ओवरएक्सपोजर की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि प्लेट से स्कैन की गई छवि उच्च पृष्ठभूमि के साथ आती है और धब्बों के क्षेत्रों को मापना मुश्किल हो जाता है।
निष्कर्ष निकालने के लिए, ब्लू-एलईडी रोशनी विधि अन्य मात्रात्मक क्रोमैटोग्राफिक विधियों की तुलना में नमूनों की उपज की मात्रा को गति देने के लिए एक अपेक्षाकृत सुरक्षित, समय-बचत, सस्ती और कम श्रमसाध्य दृष्टिकोण है; इसलिए, यह दृष्टिकोण सीमित बजट के साथ विकासशील प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए एक आदर्श प्रोटोकॉल है। इस बीच, नीली-एलईडी रोशनी विधि से प्राप्त टीएलसी प्लेट छवियां यूवी डिटेक्शन विधि (चित्रा 3 ए बनाम) की तुलना में बहुत स्पष्ट थीं। चित्रा 4 ए), जिसने टीएलसी प्लेट पर बैंड के आयाम को ठीक से निर्धारित करने में भी मदद की, और नमूनों की उपज का अनुमान लगाने में भी मदद की।
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Disclosures
सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (मोस्ट 108-2320-बी-110-007-एमवाई 3) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
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