Summary
D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、 出芽酵母の誘導性二本鎖切断部位でのDループ形成、Dループ伸長、および産物形成を定量化します。
Abstract
細胞周期のS期およびG2期に発生したDNA二本鎖切断および鎖間架橋を含むDNA損傷は、相同組換え(HR)によって修復することができる。さらに、HRは、ストールまたは崩壊後のレプリケーションフォークレスキューの重要なメカニズムを表します。この複雑な経路の多くの可逆的および不可逆的なステップの調節は、その忠実度を促進します。HR中に形成される組換え中間体の物理的分析により、さまざまな核タンパク質因子とその相互作用因子によるこれらのコントロールの特性評価が可能になります。組換え経路の特定のイベントと中間体をアッセイする方法は十分に確立されていますが、この経路の2つの重要なステップであるDループの形成と伸長の検出は、最近まで困難であることが証明されていました。ここでは、HR経路における重要なイベント、すなわちDNA二本鎖切断形成、Dループ形成、Dループ伸長、およびサッカロミセス・セレビシエにおける切断誘導複製(BIR)を介した産物の形成を検出するための効率的な方法について説明しています。これらのアッセイは、関連する組換え中間体および生成物を高感度で検出し、細胞の生存率とは無関係です。Dループ、Dループ伸長、およびBIR製品の検出は、近接ライゲーションに基づいています。これらのアッセイを組み合わせることで、集団レベルでのHRの動態の研究が可能になり、経路の重要なステップでHRタンパク質と調節因子の機能に細かく対処できます。
Introduction
相同組換え(HR)は、DNA二本鎖切断(DSB)、鎖間クロスリンク、およびssDNAギャップの修復の忠実度の高いメカニズムであり、DNA損傷耐性の経路でもあります。HRは、非相同末端結合(NHEJ)やトランス病変合成などのDNA損傷修復/耐性のエラーが発生しやすい経路とは異なり、修復イベントをテンプレート化するためのドナーとして無傷の相同二重鎖DNAを利用します。さらに、HR経路の主要な中間体の多くは可逆的であり、個々の経路ステップの絶妙な調節を可能にします。細胞周期のS期、G2期、およびM期の間、HRは両末端DSBの修復をめぐってNHEJと競合します1。さらに、HRは、ssDNAギャップや片側DSBを含む複製関連DNA損傷の修復、およびDNA病変バイパスのメカニズムとして、DNA複製に不可欠です2。
HR経路の重要な中間体は、変位ループまたはDループです(図1)。末端切除後、反応の中心的なリコンビナーゼであるRad51が、壊れた分子の新しく切除されたssDNAに負荷をかけ、らせん状のフィラメント2を形成します。次に、Rad51は相同性検索を実行して、適切な相同ドナー、通常は体細胞内の姉妹染色分体を同定します。Dループは、Rad51-ssDNAフィラメントが相同二重鎖DNAに侵入すると形成され、切断された鎖とドナーの相補鎖とのワトソン-クリック塩基対形成をもたらし、反対側のドナー鎖を置換します。DNAポリメラーゼによる切断鎖の3'末端の伸長は、DNA損傷イベント中に失われた塩基を置き換え、合成依存性鎖アニーリング(SDSA)、ダブルホリデイジャンクション(dHJ)、または切断誘発複製(BIR)HRサブ経路を介して、拡張されたDループ中間体のdsDNA産物への分離を促進します。
HR経路の中間体を物理的にモニタリングするアッセイは、各ステップの遺伝的要件の分析(すなわち、パスウェイ解析)を可能にする。DSB形成、末端切除、dHJ、BIR複製バブル、およびHR産物は、サザンブロッティング3,4,5,6,7によって容易に観察されます。しかし、サザンブロッティングはDループの発生期および伸長について報告していないため、これらの関節分子を確実に測定するための代替方法が必要です4,8,9。新生Dループ形成を分析するために広く使用されている戦略の1つは、定量的PCR(qPCR)と組み合わせたRad51のクロマチン免疫沈降(ChIP)です10,11。しかしながら、ChIP-qPCRによって測定されるdsDNAとのRad51会合は、配列相同性およびRad51付属因子Rad5410、11とは無関係である。対照的に、ここで紹介するDループキャプチャ(DLC)アッセイと呼ばれるDループ分析の方法を使用したかなりのシグナルは、DSB形成、配列相同性、Rad51、およびRad51アクセサリータンパク質Rad52およびRad54に依存します8。サッカロマイセス・セレビシエRad51が促進したDループ形成がin vivoのRad54に依存するという発見は、Rad54が相同性検索と出芽酵母Rad51によるDループ形成に必要であることを示す多数のin vitro再構成実験と一致しています8,12,13,14,15。
主に半定量的PCRによるDループ伸長の測定に対する現在のアプローチも同様に問題があります。D-loop伸長を検出するための典型的なPCRベースのアッセイは、切断部位と異所性ドナーとの間の組換えおよびその後の組換え関連DNA合成から生じる固有の配列を、切断鎖上の相同性領域の上流のプライマーおよびドナー鎖上の相同性領域の下流にある別のプライマーを介して増幅する。この方法を使用する場合、組換え関連DNA合成の検出には、必須ではないPol δ処理性因子Pol32が必要です16。この発見は、POL32欠失がインビボでの遺伝子変換に軽度の影響を与えるという観察と矛盾する17。さらに、これらのPCRベースのアッセイは、Dループの伸長とBIR産物の形成を時間的に解決できず、シグナルがssDNA中間体ではなくdsDNA産物に起因することを示唆しています17,18,19。Dループ伸長(DLE)アッセイは、これらの不一致に対処するために最近開発されました。DLEアッセイは、最初の3'浸潤末端9の下流~400塩基対(bp)の部位での組換え関連DNA合成を定量します。この方法では、Dループの伸長はPol32とは無関係であり、DSB誘導後4時間以内に検出可能ですが、BIRプロダクトは6時間で最初に観察されます。実際、ハーバー研究所とマルコバ研究所からの最近の出版物は、ゲノムDNAの調製この方法を単独で使用すると、ssDNAの保存がもたらされることを指摘しています9,20。
ここでは、DLCおよびDLEアッセイについて詳細に説明する。これらのアッセイは、S. cerevisiaeの新生および伸長Dループを検出するために近接結紮に依存しています(図2)8,9。BIR製品は、これと同じアッセイシステムを使用して定量できます。両方のアッセイについて、染色体上のURA3遺伝子座に位置するHOエンドヌクレアーゼ切断部位でのDSB形成(Chr.V)は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でのHOエンドヌクレアーゼの発現によって誘導される。Rad51を介したDNA鎖の侵入は、Chr. IIのLYS2遺伝子座に位置する異所性ドナーの部位で新生Dループ形成を引き起こします。DSBの右側はドナーとの相同性を欠いているため、SDSAおよびdHJ形成による修復は実行不可能です。BIRによるDSBの初期修復は可能であるが、生存可能な生成物の形成はセントロメア21の存在によって阻害される。この意図的な設計により、生産的なDSB修復が妨げられ、それによって、時間経過分析中に培養物を追い越す可能性のある、修復されたDBSを持つ細胞による増殖の再開を回避します。
DLCアッセイでは、Dループ内のヘテロ二本鎖DNAの2本鎖のソラレン架橋は、組換え中間体を保存します。切断された(切除された)鎖上の制限酵素部位の修復および消化に続いて、架橋は相同な切断およびドナーDNAの上流のユニークな配列のライゲーションを可能にする。qPCRを使用して、各サンプルに存在するキメラDNA分子のレベルを定量します。DLEアッセイでは、架橋は不要であり、制限酵素部位の回復と消化に続いて分子内ライゲーションを行い、代わりに壊れた分子の5'末端を新しく伸長した3'末端に結合させます。ここでも、qPCRを使用して、各サンプル中のこのキメラ産物の相対量を定量します。制限酵素部位の修復がない場合、DLEアッセイは、Dループ伸長後に形成されるBIR(dsDNA)産物の相対レベルについて報告します。
野生型株を用いた各アッセイの代表的な結果が示され、組換え変異株の分析のためのこれらのアッセイの使用について、読者はPiazzaら8およびPiazzaら9に参照される8、9。この貢献の目的は、他のラボがDLCおよびDLEアッセイを採用できるようにすることであり、リクエストに応じてそれらのサポートを利用できます。
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Protocol
1.成長前、DSB誘導、およびサンプル収集
注:Ade-株には、0.01%のアデニンをすべての培地に補充することをお勧めします。.
- 酵母ペプトンデキストロースアデニン(YPDA)(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース、2%寒天、0.001%アデニン)に適切な一倍体株( 表1を参照)をストリークアウトし、30°Cで2日間増殖させます。
- シングルコロニーを使用して、15 mLのガラス培養チューブに5 mLのYPDAを接種します。培養物を30°Cで飽和まで成長させ、通気のために振とうまたは回転させます。
- DLCアッセイ:5xソラレンストック溶液(200プルーフエタノール中の0.5 mg / mLトリオキシサレン)を、アルミホイルで包んだ50 mLコニカルチューブにソラレンを溶解し、室温で一晩、連続的に振とうまたは反転させることにより、ドラフトで調製します。蒸発を防ぐために、スクリュートップを透明フィルムで密封します。ソラレンの適切な溶解を確実にするために、50 mLのコニカルチューブあたり7 mLを超える5xソラレンストック溶液を調製しないでください。.
- 翌日、5 mLのYPDAを一晩培養して、50-100 mLのYEP乳酸塩(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%w/w乳酸塩、0.001%アデニン)を適切なサイズのフラスコに接種します(出芽酵母は、培養物の少なくとも5倍の容量のフラスコで最適に増殖します)OD600 ~0.03。
- 培養物を30°Cで~16時間増殖させ、220rpmで振とうします。~16時間後、培養液のOD600 を測定すると、~0.5-0.8になります。生い茂った文化や生い茂った文化は使用しないでください。
- 各時点について、適切な量の細胞を円錐形のチューブに集め、氷の上に置きます。通常、これはDLCアッセイの場合は1 x 108細胞(一倍体野生株の場合はOD 600 1.0で約7.5 mLの培養)、DLEアッセイの場合は5 x 107細胞(OD600 1.0で約2.5 mLの培養)です。
- OD 600値の精度を確保するには、OD600≥0.2の培養液に対して1:5希釈液を調製して、OD測定値を0.2以下に保ちます。野生型株の場合、DLC分析の最適時点は2時間から6時間の間であり、DLE分析の最適時点は4時間から8時間の間です(図3および図4を参照)。
- DLCアッセイ
- 各時点の前に、ホイルで包まれた50 mLコニカルチューブ内のすべてのサンプルに対して、ヒュームフードで十分な1xソラレン溶液(0.1 mg/mLトリオキサレン、50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM EDTA pH 8.0、20%エタノール)を準備します。RTに出発します。
- サンプルを2,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットをヒュームフード内の2.5 mLの1xソラレン溶液に再懸濁し、60 mm x 15 mmのペトリ皿に移します。あるいは、ペレットを2.5 mLのTE1溶液(50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM EDTA pH 8.0)に再懸濁して、非架橋制御を行います。
- サンプルをクロスリンクします。長波(365 nm)電球に適合するUV架橋剤の場合は、-20°Cで事前に冷却されたプラスチックまたはプレキシガラスプレートの上に蓋を外した状態で、UV光源の1〜2 cm下にペトリ皿を配置します。UVライトボックスの場合は、ペトリ皿をUV光源の真上に置きます。穏やかに振とうしながらサンプルを10分間露光します。
注意: UV光源は、~50rpmに設定されたオービタルシェーカーの上に設定することをお勧めします。 - ドラフト内で、サンプルを新しい15 mLチューブに移します。ペトリ皿を2.5 mLのTE1溶液ですすぎ、これをチューブに加えます。サンプルを2,500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を適切に廃棄し、ペレットを-20°Cで保存します。 サンプルは、次のステップに進む前に最大1週間保存できます。
- DLEアッセイ
- サンプルを2,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 スピンを繰り返して-20°Cで保存する前に、2.5 mLの冷たいTE1溶液でセルペレットを洗浄します。 サンプルは、次のステップに進む前に最大1週間保存できます。
- 0時間での試料採取のために、20%ガラクトースを添加する前に試料を採取する。その後の時点で、20%ガラクトースを最終濃度2%まで培養物に添加することにより、DSB形成を誘導します。上記のように残りのサンプルを収集し、ペレットし、DSB誘導後の時間に対して凍結する(すなわち、20%ガラクトースの添加の4時間後に4時間サンプルを収集する)。
2. 細胞形成、溶解、制限部位の修復
- サンプルを氷上で解凍します。ドライバスを30°Cに予熱します。
- サンプルを1 mLのスフェロプラストバッファー(0.4 M ソルビトール、0.4 M KCl、40 mMリン酸ナトリウムバッファーpH 7.2、0.5 mM MgCl2)に再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- 3.5 μLのザイモリアーゼ溶液(2%グルコース、50 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mg/mL ザイモリアーゼ100T、17.5 μg/mLザイモリアーゼ最終濃度)を加えます。タップまたは反転して穏やかに混ぜます。30°Cで15分間インキュベートし、氷の上に置きます。15分間のインキュベーション中に、液体窒素またはドライアイスを入手します。
- 4°Cで2,500 x g で3分間遠心分離し、サンプルを氷上に置きます。サンプルを1 mLのスフェロプラストバッファーで3回洗浄します。サンプルを4°Cで2,500 x g で3分間遠心分離します。
- サンプルを1 mLの冷たい1x制限酵素バッファー(50 mM酢酸カリウム、20 mM酢酸トリス、10 mM酢酸マグネシウム、100 μg/mL BSA pH ~8.0 室温)に再懸濁し、4°Cで16,000 x g で3分間遠心分離します。 サンプルを氷の上に置きます。洗浄を1回繰り返します。
- サンプルを1 mLの冷たい1x制限酵素バッファーに再懸濁します。サンプル(各0.5 mL)を2本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに分割します。サンプルを4°Cで16,000 x g で3分間遠心分離します。
- 各サンプルのチューブ1本をハイブリダイズオリゴを含む1.4倍制限酵素バッファー180 μLに再懸濁し( 表2を参照)、オリゴをハイブリダイズせずに180 μLの1.4倍制限酵素バッファーに1本チューブを再懸濁します。各ハイブリダイジングオリゴを1x TE(10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0)に再懸濁し、最終濃度7 nMで使用します。1x TEは、ハイブリダイズオリゴを使用せずに、1.4x制限酵素バッファー中のハイブリダイズオリゴを置き換えます。
注:ハイブリダイジングオリゴは、作業希釈で少量のアリコートで-20°Cで保存する必要があります。ハイブリダイズするオリゴの濃度は最適化を必要とするかもしれません。「ディスカッション」を参照してください。 - サンプルを液体窒素またはドライアイス/エタノールでスナップ凍結し、-80°Cで保存します。 サンプルはこの段階で数ヶ月間保管することができます。
3. 制限酵素消化物と分子内ライゲーション
- サンプルを氷上で解凍します。1つのドライバスを65°Cに、もう1つのドライバスを37°Cに予熱します。
- 36 μLのサンプルを氷上で新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。残りのサンプルは速やかに-80°Cに戻して保管してください。
- 4 μLの1% SDS(最終濃度0.1%)を加え、チューブの側面を軽くたたいて混ぜます。65°Cで15分間インキュベートし、5分ごとに軽くたたきます。インキュベーション直後にサンプルを氷上に置きます。
注:このSDS処理は、制限酵素消化および分子内ライゲーションステップの前に、DNA関連タンパク質の変性、核膜の可溶化、およびクロマチンアクセシビリティを促進します。 - 4.5 μLの10%トリトンX-100(1%最終濃度)を加え、ピペッティングで混合します。各サンプルに20〜50 Uの制限酵素(EcoRI-HFまたは HindIII-HF)を加え、37°Cで1時間インキュベートし、20〜30分ごとに穏やかに攪拌します。この間、ドライバスを55°Cに予熱し、ウォーターバスを16°Cにプリセットします。
- 各サンプルに8.6 μLの10% SDS(最終濃度1.5%)を加え、ピペッティングとタッピングで混合します。55°Cで10分間インキュベートします。各サンプルに10%Triton X-100(最終濃度6%)を80 μL加え、ピペッティングで混合します。
- ATPを含まない660 μLの1xライゲーションバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM MgCl 2、10 mM DTT、2.5 μg/mL BSA)+ 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNAリガーゼ(8 U/サンプル)を各サンプルに加え、穏やかな反転で混合します。16°Cで1.5時間インキュベートし、30分ごとに反転させます。インキュベーション直後にサンプルを氷上に置きます。
4. DNA精製
- 1つのドライバスを65°Cに、もう1つのドライバスを37°Cに予熱します。 各サンプルに1 μLの10 mg/mLプロテイナーゼK(1x TE pH 8.0で調製)を加えます(最終濃度12.5 μg/mL)。65°Cで30分間インキュベートし、インキュベーション直後にサンプルを氷上に置いて冷えます。
- サンプルを2 mLチューブに移します。ドラフト内で作業し、各サンプルに等量(~800 μL)のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(P/C/IA;pH 8.0)を加えます。サンプルを~30秒間ボルテックスし、マイクロ遠心分離機で16,000 x g で5〜10分間遠心分離します。
- 各サンプルの上相600 μLを新しい1.5 mLチューブに慎重に取り出します。下相と2mLチューブは適切に廃棄してください。
- 各サンプルに1/10容量の3 M酢酸ナトリウムpH 5.2(~60 μL)を加え、続いて1容量のイソプロパノール(~660 μL)を加えてDNAを沈殿させます。サンプルを5倍〜10倍反転させ、RTで30分間インキュベートします。
- サンプルを氷上に2分間置き、マイクロ遠心分離機でサンプルを16,500 x g で4°Cで15分間遠心分離します。サンプルを氷に戻し、上清を注ぎ、ペーパータオルでチューブを排出します。
- DNAペレットを200 μLの70%エタノールで洗浄します。16,500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、サンプルを氷上に戻し、上清を注ぎ、ピペットで残留アルコールを除去します。チューブのキャップを開いた状態でサンプルを37°Cで15〜20分間乾燥させます。
- DNAペレットをボルテックスにより1x TEの50 μLに再懸濁します。RTで30分間インキュベートし、ボルテックスした後、37°Cのドライバスで30分間インキュベートします。サンプルを再度ボルテックスしてから、氷の上に置きます。サンプルはこの段階で-20°Cで数ヶ月間保存できますが、脱架橋(DLCのみ)およびqPCRステップをすぐに進めることをお勧めします。
5.ソラレン架橋反転(DLCアッセイのみ)
- 精製されたDNA9 μLを氷上でPCRチューブに入れます。1 M KOH(最終濃度0.1 M)を1 μL加えます。サンプルをサーモサイクラーで90°Cで30分間インキュベートします。
- 19.73 μLの酢酸ナトリウム溶液(0.1 M酢酸ナトリウム、9.6 mM トリス塩酸塩pH 8.0、1.0 mM EDTA pH 8.0)を加えます。サンプルはこの段階で-20°Cで数ヶ月間保存できますが、すぐにqPCRステップに進むことをお勧めします。
6. 定量的PCR、コントロール、および分析
- 2 μLの精製DNAを使用して、架橋の有無にかかわらず、製造元の指示に従って20 μLのqPCR反応を設定します。各リアクションを重複して設定します。DLCアッセイとDLEアッセイの両方で、5つのコントロール反応と1つのDLC/DLE定量反応、またはサンプルあたり合計6つの反応が重複して実行されます。付表 S1 および 付録S2 は、これらの反応および分析をセットアップするためのテンプレートを提供し、qPCRプライマーの配列を 表3に列挙する。
- qPCRサイクル条件は、qPCRキットごとに最適化する必要があります。
- 使用する qPCR キットに応じて、以下のDLC qPCR条件を使用します: 初期変性 (95 °C で 3 分間);50ラウンドの増幅(1回のアクイジションで95°Cで15秒、61°Cで25秒、72°Cで15秒)。融解曲線解析(95°Cで5秒間、65°Cで1分間、97°Cで連続取得);冷却(37°Cで30秒間)。
- DLEアッセイには以下のqPCR条件を使用します:初期変性(95°Cで5分間);50ラウンドの増幅(1回の取得で15秒間で95°C、30秒間で60°C、15秒間で72°C);融解曲線解析(95°Cで5秒間、65°Cで1分間、97°Cで連続取得);冷却(37°Cで30秒間)。異なるqPCRマシン/キットの最適化が必要な場合があることに注意してください。
- DLCアッセイ
- コントロール: 表3のqPCRプライマーのリストを参照してください。プライマー結合部位のマップを 図S1に示す。関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイルについては、Aプラスミドエディター(ApE)ファイルを確認してください。 補助シーケンスファイル 1-5.
- ARG4のゲノムDNA:olWDH1760/olWDH1761を使用して、ARG4にあるdsDNAを増幅します。この反応を負荷コントロールとして使用し、このコントロールに対するDLCシグナル反応を除く他のすべての反応を正規化します。
- DAP2での分子内ライゲーション効率:DLCライゲーションと並行して分子内ライゲーションにEcoRI消化によって作成された1,904 bpフラグメントを使用します。このライゲーション接合部を横切る増幅は、分子内ライゲーション効率を報告し、DLCシグナルが正規化されるコントロールとして機能します。
- DSB誘導:olWDH1766 / olWDH1767を使用して、誘導されたDSBにまたがる領域を増幅します。
- ソラレン架橋および切除:olWDH2019/olWDH2020を使用して、 EcoRI認識部位の下流にある固有のPhiX領域を増幅します。架橋反転なしで、 ARG4 (架橋dsDNA)に対するssDNA(架橋なし)の比率を使用して、架橋効率を決定します。クロスリンク反転では、切除は ARG4に対して信号の1から0.5への漸進的な減少をもたらす。
- エコアールI認識部位の修復と切断:olWDH1768 / olWDH1764を使用して、切除された鎖上のDSBの上流にある復元されたEcoRI認識部位にまたがる領域を増幅します。olWDH1769/olWDH1763は、DAP2のEcoRI制限酵素部位にまたがる領域を増幅します。この部位でEcoRI切断を行い、分子内ライゲーションコントロールとして使用する。
- DLCシグナル:olWDH1764/olWDH1765を使用して、切除(侵入)鎖とドナーの分子内ライゲーションによって作成されたキメラDNA分子を増幅します。
- 分析: 重複する各反応のCp値の平均と標準偏差を計算します。 ARG4 ゲノムDNA qPCR Cp値を基準として使用して、他のすべてのコントロールqPCRを正規化します。DLCシグナルを DAP2の分子内ライゲーションコントロールに正規化します。2時間での標準的なDLC信号値については 、図3 を参照してください。
- コントロール: 表3のqPCRプライマーのリストを参照してください。プライマー結合部位のマップを 図S1に示す。関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイルについては、Aプラスミドエディター(ApE)ファイルを確認してください。 補助シーケンスファイル 1-5.
- DLEアッセイ
- コントロール: 表3のqPCRプライマーのリストを参照してください。プライマー結合部位のマップを 図S1に示す。関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイルについては、Aプラスミドエディター(ApE)ファイル(補足配列ファイル1〜5)を確認してください。
- ARG4のゲノムDNA:セクション6.3.1.1を参照してください。
- YLR050Cでの分子内ライゲーション効率:HindIII消化を使用して、DLEライゲーションと並行して分子内ライゲーションを受ける765 bpフラグメントを作成します。このライゲーション接合部を横切る増幅は、分子内ライゲーション効率を報告し、DLEシグナルが正規化されるコントロールとして機能します。
- DSB誘導:セクション6.3.1.3を参照してください。
- 後肢III認識部位の修復と切断:olWDH2010/olWDH2012およびolWDH2009/2011を使用して、それぞれ切除および伸長した切断鎖上の HindIII制限酵素部位にまたがる領域を増幅します。
- DLEシグナル:olWDH2009/olWDH2010を使用して、DSBの上流にある侵入鎖の切除された末端からDSBの下流の新しく伸長した末端への分子内ライゲーションによって作成されたキメラDNA分子を増幅します。
- 分析: 重複する各反応のCp値の平均と標準偏差を計算します。 ARG4 ゲノムDNA qPCR Cp値を基準として使用して、他のすべてのコントロールqPCRを正規化します。DLEシグナルを YLR050Cの分子内ライゲーションコントロールに正規化します。6時間での典型的なDLE信号値は、 図4 および以前の出版物9で報告されています。
- コントロール: 表3のqPCRプライマーのリストを参照してください。プライマー結合部位のマップを 図S1に示す。関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイルについては、Aプラスミドエディター(ApE)ファイル(補足配列ファイル1〜5)を確認してください。
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Representative Results
DLCアッセイ
DLCアッセイは、部位特異的DSBの単一のドナーへの侵入によって形成される新生および拡張Dループの両方を検出します(図2)。ソラレン架橋は、Dループ内のヘテロ二本鎖DNA を介して 切断鎖とドナーを物理的に結合します。切断の切除された鎖上の長いハイブリダイズオリゴによる制限酵素部位の修復は、制限酵素切断を可能にし、続いて切断された鎖を近位ドナーにライゲーションして、qPCRによって定量されるキメラ生成物を形成します。特に、DLCシグナルは、ソラレン架橋、ハイブリダイズオリゴ、中央リコンビナーゼ、Rad51、およびRad51アクセサリー因子Rad52およびRad548に依存します。DNAヘリカーゼ/トポイソメラーゼSgs1-Top3-Rmi1、Mph1、およびSrs2の欠失は、DLCシグナルの増加につながります。
図 3は、ハイブリダイズオリゴの有無にかかわらず、3連のDSB誘導後2時間における標準的な野生型株の代表的な結果を示す。重要なステップであるソラレン架橋が不足しているサンプルも重複して示されています。
図3に示すように、ソラレン架橋は重要なステップです。それなしでは検出可能な信号は事実上ありません8.架橋効率は、dsDNA増幅に対するssDNAの比率に基づいて測定されます。dsDNAとは異なり、ssDNAはソラレン架橋が最小限であるため、高いシグナルは架橋が成功したことを示します。架橋効率は、サンプル採取からqPCRの調製までの時間によって異なります(図3、左下のパネル)。サンプルの収集から調製までの時間が長いほど、架橋効率qPCRコントロールで観察されるシグナルは少なくなります。架橋効率qPCRコントロールのために観察されたシグナルの有意なサンプル間変動は懸念の原因であり、時間経過は破棄する必要があります。
ARG4 Cp値は、ハイブリダイズオリゴありとハイブリダイズなしオリゴサンプルの間で類似しています(図3、左上のパネル)。低いCp値は、より増幅可能なDNAが存在することを示す。これは、架橋のないサンプルの ARG4 Cp値が有意に低い理由を説明しています:架橋はqPCR増幅を妨げます。架橋ありサンプルと架橋なしサンプルのこの違いは、ssDNA/非架橋dsDNAを増幅する EcoRI切断qPCRコントロールを除くすべてのqPCRに適用されます。DLCシグナルを除くすべてのqPCRコントロールは、 ARG4 qPCRシグナルに対して正規化されています。
すべてのサンプルについて、分子内ライゲーションqPCRコントロールは適切な範囲内にあり(図3、中央パネル上部)、HOエンドヌクレアーゼ認識部位全体で増幅するqPCRコントロールの低シグナルによって証明されるように、堅牢なDSB誘導があります(図3、右上パネル)。ハイブリダイズするオリゴサンプルでは、効率的なEcoRI切断が観察され、このqPCRコントロールは低シグナルを与えます(図3、中央下のパネル)。逆に、架橋性のないハイブリダイズオリゴサンプルは、この場合、カットされていないssDNAが増幅され、ARG4 qPCRシグナル(dsDNA)に正規化されているため、架橋効率qPCRコントロールについて示されているものと同様の高いシグナルを与えます。
他のqPCRとは対照的に、DLC qPCRによって定量されるキメラ分子はライゲーションに依存するため、DLCアッセイのqPCRシグナルは分子内ライゲーションqPCRコントロールに対して正規化されます。ハイブリダイズオリゴを用いた2時間後のDLCシグナルの中央値は0.030±0.0055(図3、右下パネル)であり、このアッセイ8について以前に発表された結果と一致しています。予想通り、このシグナルはハイブリダイズオリゴとソラレン架橋の両方に依存する。
DLEアッセイ
DLEアッセイにより、部位特異的DSBに応答したDループ延長を正確にモニタリングすることができます(図2)。DLEシグナルは、鎖の侵入を媒介する反応の中心的なリコンビナーゼであるRad51に依存しているため、組換え関連DNA合成に必要であることが以前に実証されました9。さらに、DLEシグナルはPol δの触媒サブユニットであるPol3(DR、AP、WDH、未発表データ)に依存しますが、必須ではない処理係数Pol32には依存しません。DSB誘導後2時間で最初に検出可能になるDLC信号とは対照的に、DLE信号はDSB誘導後4時間で最初に顕著に増加し、4時間から6時間の間に劇的に上昇し、その後プラトーを開始し、6時間から8時間の間の信号の増加の多くはBIR生成物の形成に起因します8。9.
DLEアッセイで定量されるキメラライゲーション産物は一本鎖であるため、細胞スフェロプラストと溶解ステップが重要です。DLEシグナルの減少は、ヌクレアーゼを放出し、標的ssDNAの分解につながる可能性のあるこのステップの問題に起因する可能性があります。
図4 は、ハイブリダイズオリゴの有無にかかわらず、3連のDSB誘導後6時間における標準的な野生型株の代表的な結果を示す。オリゴをハイブリダイズしない野生型サンプルはdsDNA BIR産物のみを表し、一方、オリゴシグナルは伸長DループのssDNAとdsDNA BIR産物の両方に由来する。失敗した実験の例として、3番目のサンプルが含まれています。
ARG4 Cp値は、ハイブリダイズオリゴありとハイブリダイズなしオリゴサンプルの間で類似していた(図4、左上のパネル)。 ARG4 失敗したサンプルのCp値は著しく低く、このサンプルが成功したサンプルよりも多くのゲノムDNAを持っていることを示しています。dre シグナルではなく、qPCR コントロールの qPCR シグナルを ARG4 qPCR シグナルに正規化しました。分子内ライゲーションqPCRコントロールでは、ハイブリダイズオリゴありおよびハイブリダイズしないオリゴサンプルでは許容可能なシグナル(~0.15-0.35の間)が、失敗したサンプルではシグナルが大幅に低かった(図4、中央上部パネル)。この失敗したサンプルでは、高濃度のゲノムDNAが分子間ライゲーションにつながるため、 ARG4 qPCRコントロールによって示される大量のゲノムDNAが分子内ライゲーションの失敗を引き起こした可能性があります。
3つのサンプルすべてで、堅牢なDSB誘導がありました(図4、右上のパネル)。後肢切除された鎖および伸長鎖の両方におけるIII切断は、ハイブリダイズするオリゴの存在に依存する。伸長ストランドでは、Dループの伸長にさらに依存します。したがって、切除された鎖のHind III切断部位の増幅には、オリゴの有無のサンプル間で有意な差があり(図4、左下のパネル)、これらのサンプル間の延長鎖のHindIII認識部位での増幅の差は小さかった(図4、中央下のパネル)。
DLEシグナルは分子内ライゲーションに依存するため、分子内ライゲーションqPCRコントロールに正規化されます。ハイブリダイズオリゴを用いた6時間におけるDLEシグナルの中央値は0.53±0.17であり(図4、右下パネル)、このアッセイ9について以前に発表された結果と一致した。オリゴをハイブリダイズしない野生型試料についてのDLEシグナルは、この先行公報と同様に適合した。失敗したサンプルのDLE信号は予想よりも低く、上記のサンプルの問題を反映している可能性があります。
クロスリンク反転
dsDNA中のApT/TpA塩基対間にインターカレートされたソラレンは、UV照射時にそのフラン環およびピロン環を介して一方または両方の対向するチミン塩基に共有結合し、それぞれ(主にフラン)モノ付加物または鎖間ジ付加物(すなわち架橋)をもたらす可能性がある22。これらの修飾は、DNAポリメラーゼの進行を阻止し、定量的PCRに不可欠なDNA合成反応を阻害することが期待されます。その結果、ほとんどのdsDNAテンプレートは増幅できません(図5A、B)。対照的に、ssDNAに塩基対がないため、ソラレン架橋を起こしにくくなります。したがって、dsDNAよりも容易に増幅されるため、ssDNAとdsDNA、および長さとApT/TpA含有量が異なるdsDNAアンプリコンの相対的な定量が歪められます(図5A、B)。これらの制限を克服するために、ソラレン架橋反転ステップ23の塩基触媒および熱触媒反転を定量的PCRの前に適用した。この方法は、ピロン側単付加体のマイナー種のみを残す23,24。これにより、ゲノムdsDNAと分子内ライゲーションコントロールアンプリコンの80倍の回収が得られ、テンプレート分子の大部分が少なくとも1つのフラン側モノ付加体または鎖間架橋を有することが示されました(図5B、C)。架橋反転前後のdsDNAゲノムDNAコントロールのCp値を比較すると、架橋効率の推定値が得られ、ここに示す範囲になるはずです。短いアンプリコン以外にも、この手順では最大3 kbの長さのテンプレートを復元できます(図S2)。ssDNAアンプリコンについては変化は観察されず、ssDNAへのソラレン架橋の欠如と一致した(図5B-D)。また、架橋反転手順がDNA23を検出可能に損傷しないことも示している。非架橋ds-ssDNAセグメントに連結された架橋dsDNAセグメントを含むDLCキメラアンプリコンの回収(50 bpおよび118 bp / nt;図5A)dsDNAおよびssDNAアンプリコンの中間であり、回収率が8倍向上しました(図5B、C)。架橋反転は2つのdsDNAアンプリコンの相対レベルに影響せず、分子内ライゲーションコントロールはゲノムDNAコントロールに対して0.2〜0.25の範囲にとどまりました(図5E)。しかし、dsDNAゲノムDNAコントロールに対するssDNAアンプリコンの相対量を、dsDNAテンプレートに対するssDNAの40倍過剰から予想される0.5倍に変化させました(図5D)。同様に、部分的にssDNA DLCシグナルは、dsDNA分子内ライゲーションコントロールと比較して6.6 x 10−2から6.6 x 10−3に減少しました(図5F)。これにより、DSB誘導の4時間後にこのアプローチによって検出された染色体間ドナーのDループ関節分子の数は、細胞集団内の全破壊分子の平均1.3%であると推定されます。このような絶対推定は、ソラレンベースのdsDNAおよびssDNA増幅の歪みでは行うことができず、この追加の架橋反転ステップの価値を浮き彫りにします。
図1:相同組換えおよび分解能サブ経路。 片末端または両末端のDSB(図)またはssDNAギャップをもたらすDNA損傷に続いて、DNA末端の5'から3'の切除により、Rad51フィラメントが形成される3'ssDNAオーバーハングが、その付属品の要因によって支援されて明らかになります。次に、Rad51は、修復イベントをテンプレート化する無傷の二重鎖DNA(すなわち、ドナー)をゲノムで検索します。このプロセスはDNA鎖侵入で最高潮に達し、切断された鎖ワトソンクリック塩基が二本鎖DNAドナーの相補鎖と対になり、反対側の鎖を置換して新生Dループを形成します。このDループは、Rad51相同性検索が別のドナーを選択できるように反転させるか、DNAポリメラーゼによって拡張してDNA損傷イベント中に失われた塩基を置き換えることができます。この拡張Dループ中間体を製品に分解するために、3つのHRサブ経路が利用可能です。第一に、拡張されたDループはヘリカーゼによって破壊することができ、合成依存性ストランドアニーリング(SDSA)と呼ばれるプロセスにおいて、ブレークの新たに延長された末端を第2の末端にアニールすることを可能にする。フィルインDNA合成とライゲーションは、生成物形成につながります。あるいは、ブレークの第2の端部は、変位したドナー鎖にアニールして、二重ホリデイ接合(dHJ)を形成することができる。dHJの核酸分解分解能は、クロスオーバー(CO)または非クロスオーバー(NCO)のいずれかをもたらすが、一方、dHJ溶解(図示せず)は、NCO生成物のみをもたらす。最後に、DSBの第2末端に係合しないと、数千の塩基対がドナーから切断鎖にコピーされる変異原性プロセスである切断誘発複製(BIR)が発生します。このプロセスは、収束する複製フォークまたは染色体の終わりまで拡張できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Dループキャプチャ(DLC)、Dループ伸長(DLE)、およびブレーク誘導複製(BIR)産物形成アッセイの前提。DSB形成は、GAL1プロモーターの制御下にある部位特異的エンドヌクレアーゼによって駆動される。DSB誘導は、新生Dループの形成につながります。DLCアッセイでは、DNAの鎖間架橋がこの構造を保存し、抽出されます。制限酵素部位の復元は、長いオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって達成され、次にDNAが消化およびライゲーションされて、定量PCR(qPCR)によって定量できる生成物を形成します。DLEアッセイは、DNAが架橋されていないという点で異なり、代わりに、分子内ライゲーション産物が切断の片側のssDNAの両端の間に形成され、3'末端はDNAポリメラーゼによって伸長されています。qPCRは、キメラライゲーション産物の形成を定量するために再び使用されます。DLEアッセイによるDループ伸長の検出も同様に、制限酵素部位の修復を必要とします。対照的に、二本鎖BIR産物は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含まないDLEアッセイプライマーを使用して検出される。Rは、制限酵素部位が酵素切断に有能であることを示す。(R)は切断できない制限酵素部位を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DSB誘導後2時間でのDループのDLCアッセイ分析の代表的な結果。 サンプルを収集、調製し、このプロトコルに記載されているようにqPCRによって分析しました。青色の記号は、n=3のハイブリダイズオリゴを有する標準的な野生型株についての結果を表す。緑色の記号は、n=3のオリゴをハイブリダイズさせない野生型株についての結果を表す。太い赤い線は中央値を示しています。紫色の記号は、ソラレン架橋はないが、n = 2のハイブリダイズオリゴを有するサンプルを表す。記号は、サンプルが同じ培養物に由来することを示します。架橋効率の実験間の違いは、特定のqPCRコントロールにばらつきをもたらす可能性がありますが、実験内でこれらのqPCRコントロールにサンプル間のばらつきがない限り、問題はありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DSB誘導の6時間後のDLEアッセイ分析の代表的な結果。 サンプルを収集、調製し、このプロトコルに記載されているようにqPCRによって分析しました。青色の記号は、n=3のハイブリダイズオリゴを有する標準的な野生型株についての結果を表す。緑色の記号は、n=3のオリゴをハイブリダイズさせない野生型株についての結果を表す。太い赤い線は中央値を示しています。ハイブリダイズオリゴありおよびハイブリダイズなしオリゴサンプルは、同じ培養物に由来することに留意されたい。紫色のダイヤモンドは、n = 1のオリゴをハイブリダイズせずに失敗したサンプルを表します。記号は、サンプルが同じ培養物に由来することを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ソラレン架橋反転の代表的な結果 。 (A)ソラレン-DNAモノ付加体(*)および鎖間架橋(X)はdsDNA上で特異的に発生し、ssDNAテンプレートとは異なり、DNAポリメラーゼによる増幅を妨げます。この違いは、qPCRによるdsDNAおよびssDNA含有テンプレートの定量にバイアスをもたらします。このバイアスは、ソラレン架橋を反転させることで克服することができる。(B)dsDNA(ゲノム、ライゲーション)、ssDNA、およびDSB誘導の4時間後に得られた混合ds-ssDNA(DLC)アンプリコンの代表的なCp値。データは、個々の値と4つの生物学的反復の中央値を表します。(C)(B)のCp値から算出した架橋反転時の増幅回復率。(D)ソラレン架橋反転の有無にかかわらず、ゲノムdsDNAコントロールに対するssDNA増幅。反転すると、ssDNAアンプリコンはゲノムdsDNAコントロールの予想される0.5で増幅します。(E)ソラレン架橋反転の有無にかかわらず、ゲノムdsDNAコントロールに対するdsDNA分子内ライゲーションコントロール。(f)dsDNAライゲーションコントロールに対するDLCシグナル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:現在のDLC/DLEアッセイシステムと提案された変更。 上:現在のDLC/DLEアッセイのブレーク部位とドナーが示されています。下:DLC / DLEアッセイブレークサイトとドナーへの計画された変更。(i)117 bpのHOエンドヌクレアーゼ切断部位を黄色で示す。Dループの混乱を監視しながら交絡効果を防ぐために、HOcsの左側(74 bp)がドナーに導入され、2つの間の再結合により、3フィートのフラップがない完全に一致するDループが作成されます。(II)システムを修復可能にし、したがってより生理学的にするために、ドナーと相同なDNA(ティールとライラックで示されます)がHOcsの右側に挿入されます。(III)HOcsの右側のストランドによる侵入と伸長は、ブレークのその側に固有のシーケンスを使用して監視されます(オレンジ色で示されています)。(IV)ドナーに固有の追加の等間隔の制限酵素部位と配列により、Dループの延長(HOcsの左側からの侵入による )をより離れた部位で監視できます。この修飾系では、合成依存性ストランドアニーリング(SDSA)またはダブルホリデイ接合(dHJ)形成がティールまたはライラックで示されている部位で発生する可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:DLCおよびDLEアッセイで使用されるqPCRプライマーのマップ。 DLCおよびDLEアッセイでの分析に使用されたゲノム遺伝子座のマップ、それらの関連する特徴、およびおおよそのプライマー結合部位(qPCRプライマーのリストについては 表3 を参照)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:大型アンプリコンのクロスリンク反転の定性的評価。 ゲノムDNAは、架橋または非架橋サンプルから調製し、プロトコルのセクション1〜5に記載されているように示されます。非定量的PCRを使用して、ブレーク部位とドナーの間で共有される相同性の領域にまたがる3 kbpセグメントを増幅しました。なお、架橋DNAと非架橋DNAでは増幅効率に差があり、試料量が限られているため、入力DNAを標準化することはできなかった。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表1:DLCおよびDLEアッセイ分析に用 いたS.セレビシエ 株。 本研究で用いた一倍体出芽酵母株の遺伝子型。この菌株はご要望に応じてご利用いただけます。DLC/DLEアッセイ分析に利用可能なその他の菌株は、Piazzaら8 およびPiazzaら9に見出すことができる。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:DLCおよびDLEアッセイ分析に使用されるハイブリダイズオリゴヌクレオチド。 DLCおよびDLEアッセイに使用される長いハイブリダイズオリゴヌクレオチドの配列。カスタムオリゴヌクレオチドプロバイダーによるハイブリダイズオリゴヌクレオチドのさらなるSDS-PAGE精製が推奨される。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:DLCおよびDLEアッセイ分析に使用したqPCRプライマー。 DLCおよびDLEアッセイ用のqPCRプライマーペアとその目的の説明。olWDH1764、olWDH2009、および olWDH2010 は 2 つの qPCR で使用されていることに注意してください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:DLCアッセイqPCRのセットアップと分析のためのテンプレート。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2:DLEアッセイqPCRのセットアップと分析のためのテンプレート。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助シーケンスファイル 1-5. 関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイル。シーケンス ファイルは ApE ファイル形式です。ApEは、DNA配列を表示および編集するための無料で入手できるソフトウェアです。ApEファイルは、すべての主要なシーケンス編集ソフトウェアとも互換性があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示されたアッセイは、近接ライゲーションとqPCRを使用して、新生および伸長Dループ(DLCアッセイ)、Dループ延長(DLEアッセイ)、およびBIR産物形成(ハイブリダイズオリゴヌクレオチドを含まないDLEアッセイ)の検出を可能にします。DSBから離れた部位へのRad51のChIP-qPCRは、Rad51を介した相同性検索およびDループ形成のプロキシとして以前に使用されてきた。しかしながら、このChIP-qPCRシグナルは、切断部位と潜在的なドナーとの間の配列相同性、ならびにRad51関連因子Rad54とは無関係であり、したがって、Dループ中間体よりもRad51-ssDNAフィラメントとdsDNAとの間の一過性の関連を表す可能性が高い10,11。対照的に、DLCシグナルは、DSB形成、Rad51、Rad52、Rad54、およびDSBとアッセイされたドナー部位との間の共有配列相同性に依存する8。さらに、Mph1およびSrs2ヘリカーゼ、およびSgs1-Top3-Rmi1ヘリカーゼ-トポイソメラーゼ複合体の非存在下でDLCシグナルの増加が観察され、これらの3つの因子がin vitroでRad51/Rad54製の新生Dループを分解できるという以前の報告と一致しています8,25,26,27。DLEアッセイは、Dループ伸長とBIR産物形成を区別できるため、組換え関連DNA合成に従うための以前の方法よりも同様に改善されています19。
前述のように、ゲノムDNA、DSB誘導、ソラレン架橋、分子内ライゲーション、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションなどのqPCRコントロールは、これらのアッセイの成功と再現性にとって重要です。生ゲノムDNA qPCR値は、サンプル間でほぼ同等である必要があります。 ARG4 ゲノムDNAコントロールの低いCp値は過剰なDNAを示しており、収集される細胞の数を調整する必要があります。このコントロールの高いCp値は、不十分なDNA回収またはqPCRを妨害する試薬による汚染を示しています。スフェロプラストに続いて、標準的な光学顕微鏡と等量のサンプルと滅菌水を使用して細胞溶解を観察することができます。水を添加しても溶解が不十分な場合は、ザイモリアーゼ溶液を作り直すか、30°Cでのインキュベーションを延長する必要があります。サンプルは、P / C / IA抽出によるDNA精製中に失われたり、汚染物質が導入されたりする可能性があります。DNAを効率的に回収するには、P/C/IAのpHが~8.0に調整され、上相を除去する際に底相が乱されないようにする必要があります。最後に、1x TE中のDNAペレットの非効率的な再懸濁は、低いCp値をもたらす可能性があります。37°Cでのより長いインキュベーションとボルテックスは、DNAペレットの再懸濁を改善します。
ゲノムDNAゲノムDNA制御に加えて、DSB誘導および制限酵素切断制御反応もサンプル間で類似している必要があります。DSBまたは制限酵素認識部位の部位におけるHOエンドヌクレアーゼまたは制限酵素切断は、この領域全体の増幅を防止する;したがって、これらのコントロールの典型的な正規化されたqPCR値はゼロに近く、qPCR値が高い場合は切断が不十分であることを示します。DSBの部位で高信号が観察された場合は、ガラクトース溶液を再作成する必要があります。既知の細胞周期欠損を有する変異体の場合、DSB誘導は、ガラクトースを添加したYPDAおよびYPA培地上でプロトコル(セクション1を参照)に従って増殖させた同量の培養物をプレーティングすることによって定量化する必要があります。ガラクトースを含む培地上で増殖するコロニーは、末端結合が切断可能なHOcsを作成した酵母を表します。野生型と比較して関心のある変異体の末端結合イベントが有意に多い場合は、DLC/DLE信号に影響を与えるDSB誘導のこの差を補正するために補正を適用する必要があります。
3つのプライマーペア(olWDH1764/olWDH1768、olWDH2010/olWDH2012、およびolWDH2009/olWDH2011)は、ハイブリダイズオリゴによる制限酵素部位の復元と、EcoRI-HFおよびHindIII-HF制限酵素による切断を評価します。さらに、分子内ライゲーション制御は、適切な制限酵素消化にも依存する。したがって、分子内ライゲーション効率が低く、これら3つのプライマーペアの1つに対するシグナルが高いサンプルは、制限酵素切断が不十分です。追加の制限酵素はその後の調製で提供されるべきであり、制限酵素の有効性はゲノムDNA上で評価されるべきである。olWDH1769/olWDH1763プライマーペアは、分子内ライゲーション効率も測定されるDAP2でのEcoRI切断を測定するDLCアッセイの追加コントロールです。適切な分子内ライゲーションシグナルを有するが、これら3つのプライマーペアのうちの1つに対して高いシグナルを有するサンプルは、ハイブリダイジングオリゴによる制限酵素部位の回復が不十分である。この問題に対処するには、重複サンプルを収集し、影響を受けるハイブリダイジングオリゴの濃度を変化させる必要があります。ハイブリダイズオリゴの有無にかかわらずこれらの反応について得られた典型的なqPCR値は、図3および図4ならびにPiazzaら8およびPiazzaら9に見出すことができる。
DLCアッセイとDLEアッセイの両方で、ゲノムDNAコントロールに対して正規化された0.15〜0.35の分子内ライゲーション効率は正常と見なされます。新生および伸長DループおよびBIR産物の検出は効率的なライゲーションに依存するため、ライゲーションシグナルが低いサンプルは廃棄する必要があります。ATPを含まない10倍ライゲーションバッファーは、4°Cで6か月以内保存する必要があります。あまりにも多くの細胞を収集すると、分子間ライゲーションにつながる可能性があり、その結果、分子内ライゲーション効率とDLC / DLEシグナルが低下します。
DLCおよびDLEアッセイのこれらのコントロールは、ほぼすべての高感度ステップについて報告しますが、これらのコントロールが適切な範囲内にある場合、DLCまたはDLEシグナルの非生理学的値を取得することは可能です。DLCまたはDLEシグナルが低い場合は、非常に感度の高い細胞スフェロプラストステップのエラーに起因する可能性があります。少数のサンプルのみを並行して処理し、常に4°Cに保つ必要があります。高/低DLC / DLE信号は、各時点で収集するセルが多すぎる/少なすぎる場合にも発生する可能性があります。この問題は、各サンプルの各時点で複数のOD600sの細胞を収集することで対処できます。
現在の形態のDLCおよびDLEアッセイには、いくつかの技術的および概念的な制限があります。まず、ソラレンを介した鎖間架橋密度は、500 bp8で~1です。したがって、DLC信号の増加は、母集団内のDループが多いこと、母集団内のDループの平均長が増加していること(Dループが500 bp未満である可能性があると仮定)、またはその両方を示している可能性があります。さらに、DループがDLCアッセイによって捕捉される可能性は、Dループ長が短くなるにつれて減少します。非常に短いDループが特定の変異体バックグラウンドで全Dループ集団のかなりの部分を占める可能性があることを考えると、結果を解釈する際にアッセイのこの制限を考慮する必要があります。第二に、DLCアッセイはDNA架橋を必要としますが、DLEアッセイは必要としません。以前は、特定の実験では、DLCサンプルとDLEサンプルを別々に収集して分析する必要がありました。図5に示す方法は、堅牢な架橋反転を実現し、同じ培養物から複数のサンプルを収集する必要性を軽減します。HindIII認識部位の下流にある切断鎖に2番目のEcoRI制限酵素部位を導入することで、DLCおよびDLEの逐次解析が可能になります。
これらの技術的制限に加えて、DLCおよびDLEアッセイシステムは、誘導性DSBの右側がドナーとの相同性を欠いているため、現在、実行可能なHR産物の回収を許可していません。第2端の関与と合成の動態とメカニズムをよりよく理解するために、ブレークの第2端とドナーの間で共有される相同性の近位または遠位領域を使用した修復が実現可能であるようにシステムを変更することができます(図6)。将来的には、DLCおよびDLEアッセイをChIP-qPCR、ハイスループット染色体コンフォメーションキャプチャー(Hi-C)、 in vivo Dループマッピングなどの他のテクノロジーと組み合わせて、ブレーク形成、末端切除、Rad51フィラメント形成、新生Dループ形成など、HR経路のステップの速度論と調節の包括的な分析を達成することが洞察に満ちていることがわかります。 Dループ延長、Dループ反転、セカンドエンドエンゲージメント、セカンドエンド合成、および解像度28。
要約すると、DLCおよびDLEアッセイは、近接ライゲーションの原理を使用して、新生および拡張Dループ、Dループ伸長、およびBIR産物形成の定量を可能にします。これらのアッセイは、細胞の生存率とは無関係にDループの形成と伸長の半定量的測定を可能にする最初のアッセイであるため、この分野での大きな進歩を表しています。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
Heyer研究所での作業は、GM58015およびGM137751からW.-D.H.への助成金によってサポートされています。ピアッツァ研究所での研究は、欧州研究会議(ERC-StG 3Dループ、グランドコングリーメント851006)によってサポートされています。D.R.はT32CA108459とA.P.ジャンニーニ財団の支援を受けています。Shih-Hsun Hung(Heyer Lab)がDLC/DLEアッセイの結果を共有し、このプロトコルに詳述されているアッセイの変更をさらに検証してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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