Visualisering af konformationsdynamikken i membranreceptorer ved hjælp af enkeltmolekyle FRET
Summary
Denne undersøgelse præsenterer en detaljeret procedure til udførelse af enkeltmolekyle fluorescensresonansenergioverførsel (smFRET) eksperimenter på G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) ved hjælp af stedsspecifik mærkning via unaturlig aminosyre (UAA) inkorporering. Protokollen giver en trinvis vejledning til smFRET-prøveforberedelse, eksperimenter og dataanalyse.
Abstract
Cellernes evne til at reagere på eksterne signaler er afgørende for cellulær udvikling, vækst og overlevelse. For at reagere på et signal fra miljøet skal en celle være i stand til at genkende og behandle det. Denne opgave er hovedsageligt afhængig af funktionen af membranreceptorer, hvis rolle er at konvertere signaler til cellens biokemiske sprog. G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) udgør den største familie af membranreceptorproteiner hos mennesker. Blandt GPCR’er er metabotrope glutamatreceptorer (mGluR’er) en unik underklasse, der fungerer som obligatoriske dimerer og har et stort ekstracellulært domæne, der indeholder ligandbindingsstedet. Nylige fremskridt inden for strukturelle undersøgelser af mGluR’er har forbedret forståelsen af deres aktiveringsproces. Imidlertid er udbredelsen af store konformationsændringer gennem mGluRs under aktivering og modulering dårligt forstået. Enkeltmolekyle fluorescens resonans energioverførsel (smFRET) er en kraftfuld teknik til at visualisere og kvantificere biomolekylers strukturelle dynamik på enkeltproteinniveau. For at visualisere den dynamiske proces med mGluR2-aktivering blev der udviklet fluorescerende konformationssensorer baseret på unaturlig aminosyreinkorporering (UAA), der tillod stedsspecifik proteinmærkning uden forstyrrelse af receptorernes oprindelige struktur. Protokollen, der er beskrevet her, forklarer, hvordan man udfører disse eksperimenter, herunder den nye UAA-mærkningsmetode, prøveforberedelse og smFRET-dataindsamling og -analyse. Disse strategier er generaliserbare og kan udvides til at undersøge konformationsdynamikken i en række membranproteiner.
Introduction
Overførslen af information over plasmamembranen er stærkt afhængig af funktionen af membranreceptorer1. Ligandbinding til en receptor fører til en konformationsændring og receptoraktivering. Denne proces er ofte allosterisk i naturen2. Med over 800 medlemmer er G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) den største familie af membranreceptorer hos mennesker3. På grund af deres rolle i næsten alle cellulære processer er GPCR’er blevet vigtige mål for terapeutisk udvikling. I den kanoniske model af GPCR-signalering resulterer agonistaktivering i konformationsændringer af receptoren, der efterfølgende aktiverer det heterotrimeriske G-proteinkompleks via udveksling af BNP for GTP ved nukleotidbindingslommen af Gα. De aktiverede Gα-GTP– og Gβγ-underenheder styrer derefter aktiviteten af nedstrøms effektorproteiner og udbreder signalkaskaden 4,5. Denne signalproces afhænger i det væsentlige af ligandernes evne til at ændre receptorens tredimensionelle form. En mekanistisk forståelse af, hvordan ligander opnår dette, er afgørende for at udvikle nye terapier og designe syntetiske receptorer og sensorer.
Metabotrope glutamatreceptorer (mGluR’er) er medlemmer af klasse C GPCR-familien og er vigtige for de langsomme neuromodulerende virkninger af glutamat og tuning neuronal excitabilitet 6,7. Blandt alle GPCR’er er klasse C GPCR’er strukturelt unikke, fordi de fungerer som obligatoriske dimers. mGluR’er indeholder tre strukturelle domæner: Venus flytrap (VFT) domænet, cystein-rich domain (CRD) og transmembrane domain (TMD)8. Konformationsændringerne under aktiveringsprocessen er komplekse og involverer lokal og global konformationskobling, der forplanter sig over en afstand på 12 nm samt dimer kooperativitet. De mellemliggende konformationer, den tidsmæssige rækkefølge af stater og overgangshastigheden mellem stater er ukendte. Ved at følge konformationen af individuelle receptorer i realtid er det muligt at identificere de forbigående mellemtilstande og sekvensen af konformationsændringer under aktivering. Dette kan opnås ved at anvende enkeltmolekyle fluorescens resonans energioverførsel 9,10 (smFRET), som for nylig blev anvendt til at visualisere udbredelsen af konformationsændringer under aktiveringen af mGluR2 11. Et vigtigt skridt i FRET-eksperimenter er generering af FRET-sensorer ved stedsspecifik indsættelse af donor- og acceptorfluorophorer i det pågældende protein. En unaturlig aminosyre (UAA) inkorporeringsstrategi blev vedtaget12,13,14,15 for at overvinde begrænsningerne ved typiske stedsspecifikke fluorescerende mærkningsteknologier, der kræver oprettelse af cystein-mindre mutanter eller indsættelse af et stort genetisk kodet mærke. Dette gjorde det muligt at observere den konformationelle omlejring af den essentielle kompakte allosteriske linker, som sluttede sig til ligandbindings- og signaldomænerne i mGluR2. I denne protokol præsenteres en trinvis vejledning til udførelse af smFRET-eksperimenter på mGluR2, herunder tilgangen til stedsspecifik mærkning af mGluR2 med UAA for at fastgøre fluoroforer ved hjælp af den kobberkatalyserede azidcykliseringsreaktion. Desuden beskriver denne protokol metoden til direkte indfangning af membranproteiner og dataanalyse. Protokollen skitseret her gælder også for at studere konformationsdynamikken i andre membranproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR’er er proteiner, der fungerer på cellemembranen for at initiere signaltransduktion. Mange GPCR’er består af flere domæner, hvor signalering er afhængig af den kooperative interaktion mellem domænerne. For at modulere egenskaberne af disse membranreceptorer er det vigtigt at forstå den dynamiske opførsel af de flere domæner. Enkeltmolekyle fluorescens resonans energioverførsel (smFRET) er en fluorescensteknik, der muliggør måling af proteinkonformation og dynamik i realtid11,32…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Reza Vafabakhsh-laboratoriet for diskussioner. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-bevillingen R01GM140272 (til R.V.), af The Searle Leadership Fund for the Life Sciences ved Northwestern University og af Chicago Biomedical Consortium med støtte fra Searle Funds på Chicago Community Trust (til R.V.). B.W.L. blev støttet af National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
