JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

Published: August 17, 2022
doi:
10.3791/64254
, ,
1Department of Molecular Biosciences,Northwestern University

Summary

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

Abstract

외부 신호에 반응하는 세포의 능력은 세포 발달, 성장 및 생존에 필수적입니다. 환경의 신호에 응답하려면 세포가이를 인식하고 처리 할 수 있어야합니다. 이 작업은 주로 신호를 세포의 생화학 적 언어로 변환하는 역할을하는 막 수용체의 기능에 의존합니다. G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 단백질 계열을 구성합니다. GPCR 중에서 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 절대 이량 체로 기능하고 리간드 결합 부위를 포함하는 큰 세포 외 도메인을 보유하는 고유 한 하위 클래스입니다. mGluR의 구조 연구의 최근 발전은 활성화 과정에 대한 이해를 향상 시켰습니다. 그러나 활성화 및 변조 중에 mGluR을 통한 대규모 구조적 변화의 전파는 제대로 이해되지 않습니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단일 단백질 수준에서 생체 분자의 구조 역학을 시각화하고 정량화하는 강력한 기술입니다. mGluR2 활성화의 동적 과정을 시각화하기 위해 비천연 아미노산(UAA) 통합을 기반으로 하는 형광 입체 추적 센서가 개발되어 수용체의 고유 구조를 교란하지 않고 부위 특이적 단백질 표지를 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 새로운 UAA 라벨링 접근법, 샘플 준비, smFRET 데이터 수집 및 분석을 포함하여 이러한 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 전략은 일반화 가능하며 다양한 막 단백질의 구조적 역학을 조사하기 위해 확장 될 수 있습니다.

Introduction

원형질막을 통한 정보의 전달은 막 수용체1의 기능에 크게 의존합니다. 수용체에 대한 리간드 결합은 구조적 변화 및 수용체 활성화를 유도한다. 이 과정은 종종 자연에서 알로 스테 릭입니다2. 800명 이상의 구성원을 보유한 G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 계열입니다3. 거의 모든 세포 과정에서의 역할로 인해 GPCR은 치료 개발의 중요한 표적이되었습니다. GPCR 신호전달의 표준 모델에서, 작용제 활성화는 G α의 뉴클레오티드 결합 포켓에서 GDP를 GTP로 교환함으로써 이종 삼량 체 G 단백질 복합체를 활성화시키는 수용체의 구조적 변화를 초래한다. 활성화 된 Gα-GTP 및 Gβγ 서브 유닛은 다운 스트림 이펙터 단백질의 활성을 제어하고 신호 전달 캐스케이드 4,5를 전파합니다. 이 신호 전달 과정은 본질적으로 수용체의 3 차원 모양을 변경하는 리간드의 능력에 의존합니다. 리간드가 이를 달성하는 방법에 대한 기계론적 이해는 새로운 치료제를 개발하고 합성 수용체 및 센서를 설계하는 데 중요합니다.

대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 클래스 C GPCR 계열의 구성원이며 글루타메이트의 느린 신경 조절 효과 및 신경 흥분성 튜닝에 중요합니다 6,7. 모든 GPCR 중에서 클래스 C GPCR은 절대 이량체로 기능한다는 점에서 구조적으로 독특합니다. mGluR은 금성 파리 통 (VFT) 도메인, 시스테인이 풍부한 도메인 (CRD) 및 막 횡단 도메인 (TMD)의 세 가지 구조 도메인을 포함합니다 8. 활성화 과정 동안의 구조적 변화는 복잡하며 12nm 거리에 걸쳐 전파되는 국소 및 글로벌 구조적 결합과 이량체 협력성을 포함합니다. 중간 형태, 상태의 시간적 순서 및 상태 간의 전환 속도는 알려져 있지 않습니다. 개별 수용체의 형태를 실시간으로 추적함으로써 일시적인 중간 상태와 활성화 중 구조적 변화의 순서를 식별 할 수 있습니다. 이는 mGluR2 11의 활성화 동안 구조적 변화의 전파를 시각화하기 위해 최근에 적용된 것처럼 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 9,10(smFRET)을 적용하여 달성할 수 있습니다. FRET 실험의 핵심 단계는 공여체 및 수용체 형광단을 관심 단백질에 부위 특이적으로 삽입하여 FRET 센서를 생성하는 것입니다. 비천연 아미노산(UAA) 혼입 전략이 채택되었습니다 12,13,14,15 시스테인이 없는 돌연변이를 생성하거나 유전적으로 암호화된 큰 태그를 삽입해야 하는 일반적인 부위 특이적 형광 표지 기술의 한계를 극복하기 위해. 이를 통해 mGluR2의 리간드 결합 및 신호 전달 도메인에 합류하는 필수 콤팩트 알로스테릭 링커의 구조적 재배열을 관찰할 수 있었습니다. 이 프로토콜에서는 구리 촉매 아지드 고리화 반응을 사용하여 형광단을 부착하기 위해 UAA로 mGluR2의 부위별 라벨링에 대한 접근 방식을 포함하여 mGluR2에 대한 smFRET 실험을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제시됩니다. 또한, 이 프로토콜은 막 단백질의 직접 포획 및 데이터 분석을 위한 방법론을 설명합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 막 단백질의 구조적 역학을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.

Protocol

프로토콜의 전체 워크플로는 그림 1에 설명되어 있습니다. 1. 샘플 챔버의 준비 슬라이드 및 커버슬립 청소알림: 이 단계는 슬라이드의 표면과 커버슬립을 청소하고 아미노실란화를 준비하는 것을 목표로 합니다. 표면 결합 분자에 대한 단일 분자 형광 실험을 수행하기 위한 한 가지 중요한 요구 사항은 부동태화 표면입니다. 가장 신뢰할 ?…

Representative Results

UAA 기반 FRET 센서의 발현 및 형광 표지본원에서, mGluR2(548UAA)의 CRD 내 UAA(AZP)의 삽입 및 형광 표지의 예시적인 결과가 논의된다 도11에 논의된다. 앞서 언급했듯이 AZP를 mGluR2에 삽입하려면 변형된 tRNA 신테타제 및 상보성 tRNA(pIRE4-Azi)와 돌연변이 유발을 사용하여 생성된 위치 548에 호박색 코돈을 포함하는 mGluR2를 포함하는 조작된 번역 기계의 동시 발현이 필요합니다…

Discussion

GPCR은 신호 전달을 시작하기 위해 세포막에서 작동하는 단백질입니다. 많은 GPCR은 여러 도메인으로 구성되며 신호는 도메인 간의 협력 상호 작용에 의존합니다. 이러한 막 수용체의 특성을 조절하려면 여러 도메인의 동적 거동을 이해하는 것이 필수적입니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단백질 형태 및 역학을 실시간으로 측정할 수 있는 형광 기술입니다(11,32</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

토론을 위해 Reza Vafabakhsh 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R01GM140272 (RV), 노스 웨스턴 대학의 생명 과학을위한 Searle 리더십 기금 및 시카고 커뮤니티 트러스트의 Searle Funds의 지원을 받아 시카고 생물 의학 컨소시엄 (RV). BWL은 국립 일반 의학 연구소 (NIGMS) 교육 보조금 T32GM-008061의 지원을 받았습니다.

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Keywords: Single-molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMGluR2HEK 293T CellsPEGylationAmino SalinizationDremelAcetonePotassium HydroxideMethanolPoly-L/D-lysineTransfectionAlkyne Cyanine Dyes
check_url/64254?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image