Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi
Summary
Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.
Abstract
Hücrelerin dış sinyallere cevap verme yeteneği, hücresel gelişim, büyüme ve hayatta kalma için gereklidir. Ortamdan gelen bir sinyale yanıt vermek için, bir hücre onu tanıyabilmeli ve işleyebilmelidir. Bu görev esas olarak, rolü sinyalleri hücrenin biyokimyasal diline dönüştürmek olan membran reseptörlerinin işlevine dayanır. G proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler), insanlarda membran reseptör proteinlerinin en büyük ailesini oluşturur. GPCR’ler arasında, metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR’ler), zorunlu dimerler olarak işlev gören ve ligand bağlanma bölgesini içeren geniş bir hücre dışı alana sahip benzersiz bir alt sınıftır. mGluR’lerin yapısal çalışmalarındaki son gelişmeler, aktivasyon süreçlerinin anlaşılmasını geliştirmiştir. Bununla birlikte, aktivasyon ve modülasyon sırasında mGluR’ler yoluyla büyük ölçekli konformasyonel değişikliklerin yayılması tam olarak anlaşılamamıştır. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), biyomoleküllerin yapısal dinamiklerini tek protein seviyesinde görselleştirmek ve ölçmek için güçlü bir tekniktir. mGluR2 aktivasyonunun dinamik sürecini görselleştirmek için, reseptörlerin doğal yapısını bozmadan bölgeye özgü protein etiketlemesine izin veren doğal olmayan amino asit (UAA) entegrasyonuna dayanan floresan konformasyonel sensörler geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokol, yeni UAA etiketleme yaklaşımı, numune hazırlama ve smFRET veri toplama ve analizi dahil olmak üzere bu deneylerin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Bu stratejiler genelleştirilebilir ve çeşitli membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini araştırmak için genişletilebilir.
Introduction
Plazma zarı boyunca bilgi aktarımı büyük ölçüde membran reseptörlerinin işlevine bağlıdır1. Bir reseptöre bağlanan ligand, konformasyonel bir değişikliğe ve reseptör aktivasyonuna yol açar. Bu süreç genellikle doğada allosteriktir2. 800’den fazla üyesi olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler), insanlarda membran reseptörlerinin en büyük ailesidir3. Neredeyse tüm hücresel süreçlerdeki rolleri nedeniyle, GPCR’ler terapötik gelişim için önemli hedefler haline gelmiştir. GPCR sinyallemesinin kanonik modelinde, agonist aktivasyonu, daha sonra Gα nükleotid bağlanma cebinde GTP için GDP değişimi yoluyla heterotrimerik G protein kompleksini aktive eden reseptörün konformasyonel değişiklikleriyle sonuçlanır. Aktive edilen Gα-GTP ve Gβγ alt üniteleri daha sonra aşağı akış efektör proteinlerinin aktivitesini kontrol eder ve sinyal kaskadın 4,5’i yayar. Bu sinyal verme işlemi esas olarak ligandların reseptörün üç boyutlu şeklini değiştirme yeteneğine bağlıdır. Ligandların bunu nasıl başardığına dair mekanik bir anlayış, yeni terapötikler geliştirmek ve sentetik reseptörler ve sensörler tasarlamak için kritik öneme sahiptir.
Metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR’ler) C sınıfı GPCR ailesinin üyeleridir ve glutamatın yavaş nöromodülatör etkileri ve nöronal uyarılabilirliğin ayarlanması için önemlidir 6,7. Tüm GPCR’ler arasında, C sınıfı GPCR’ler, zorunlu dimerler olarak işlev görmeleri nedeniyle yapısal olarak benzersizdir. mGluR’ler üç yapısal alan içerir: Venüs flytrap (VFT) alanı, sistein bakımından zengin etki alanı (CRD) ve transmembran alanı (TMD)8. Aktivasyon işlemi sırasındaki konformasyonel değişiklikler karmaşıktır ve 12 nm mesafeye yayılan yerel ve küresel konformasyonel kuplajın yanı sıra dimer kooperatifçiliğini de içerir. Ara konformasyonlar, devletlerin zamansal sıralaması ve devletler arasındaki geçiş hızı bilinmemektedir. Bireysel reseptörlerin konformasyonunu gerçek zamanlı olarak takip ederek, geçici ara durumları ve aktivasyon sırasında konformasyonel değişikliklerin sırasını tanımlamak mümkündür. Bu, mGluR2 11’in aktivasyonu sırasında konformasyonel değişikliklerin yayılımını görselleştirmek için yakın zamanda uygulandığı gibi, tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi 9,10 (smFRET) uygulanarak elde edilebilir. FRET deneylerinde önemli bir adım, donör ve alıcı floroforların ilgili proteine bölgeye özgü yerleştirilmesiyle FRET sensörlerinin üretilmesidir. Sisteinsiz mutantların oluşturulmasını veya genetik olarak kodlanmış büyük bir etiketin eklenmesini gerektiren tipik bölgeye özgü floresan etiketleme teknolojilerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için doğal olmayan bir amino asit (UAA) birleştirme stratejisi 12,13,14,15 benimsenmiştir. Bu, mGluR2’nin ligand bağlama ve sinyal alanlarını birleştiren temel kompakt allosterik bağlayıcının konformasyonel olarak yeniden düzenlenmesinin gözlenmesine izin verdi. Bu protokolde, bakır katalizörlü azid siklizasyon reaksiyonunu kullanarak floroforları bağlamak için mGluR2’nin UAA ile sahaya özgü etiketlenmesi yaklaşımı da dahil olmak üzere, mGluR2 üzerinde smFRET deneyleri gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sunulmaktadır. Ayrıca, bu protokol membran proteinlerinin doğrudan yakalanması ve veri analizi için metodolojiyi açıklamaktadır. Burada özetlenen protokol, diğer membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini incelemek için de geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR’ler, sinyal iletimini başlatmak için hücre zarı üzerinde çalışan proteinlerdir. Birçok GPCR, birden fazla alandan oluşur ve sinyalleme, etki alanları arasındaki işbirlikçi etkileşime bağlıdır. Bu membran reseptörlerinin özelliklerini modüle etmek için, çoklu alanların dinamik davranışını anlamak önemlidir. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), protein konformasyonu ve dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayan bir floresan tekniğidir<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reza Vafabakhsh laboratuvarı üyelerine tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01GM140272 (R.V.’ye), Northwestern Üniversitesi’ndeki Yaşam Bilimleri için Searle Liderlik Fonu ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından Chicago Community Trust’taki Searle Funds’ın desteğiyle desteklenmiştir. B.W.L., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) Eğitim Hibe T32GM-008061 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
