Визуализация конформационной динамики мембранных рецепторов с помощью одномолекулярного FRET
Summary
В этом исследовании представлена подробная процедура проведения экспериментов по переносу энергии одномолекулярного флуоресцентного резонанса (smFRET) на рецепторах, связанных с G-белком (GPCR), с использованием сайт-специфической маркировки через включение неестественных аминокислот (UAA). Протокол содержит пошаговое руководство по подготовке образцов smFRET, экспериментам и анализу данных.
Abstract
Способность клеток реагировать на внешние сигналы имеет важное значение для клеточного развития, роста и выживания. Чтобы реагировать на сигнал из окружающей среды, клетка должна уметь распознавать и обрабатывать его. Эта задача в основном опирается на функцию мембранных рецепторов, роль которых заключается в преобразовании сигналов в биохимический язык клетки. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), составляют крупнейшее семейство мембранных рецепторных белков у людей. Среди GPCR метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются уникальным подклассом, которые функционируют как облигатные димеры и обладают большим внеклеточным доменом, содержащим лиганд-связывающий сайт. Последние достижения в структурных исследованиях mGluRs улучшили понимание процесса их активации. Однако распространение крупномасштабных конформационных изменений через mGluRs во время активации и модуляции плохо изучено. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) является мощным методом визуализации и количественной оценки структурной динамики биомолекул на уровне одного белка. Для визуализации динамического процесса активации mGluR2 были разработаны флуоресцентные конформационные датчики на основе включения неестественных аминокислот (UAA), которые позволили маркировать сайт-специфический белок без возмущения нативной структуры рецепторов. Протокол, описанный здесь, объясняет, как выполнять эти эксперименты, включая новый подход к маркировке UAA, подготовку образцов и сбор и анализ данных smFRET. Эти стратегии являются обобщаемыми и могут быть расширены для исследования конформационной динамики различных мембранных белков.
Introduction
Передача информации через плазматическую мембрану сильно зависит от функции мембранных рецепторов1. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению и активации рецептора. Этот процесс часто носит аллостерический характер2. С более чем 800 членами, рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим семейством мембранных рецепторов у людей3. Благодаря своей роли почти во всех клеточных процессах, GPCR стали важными мишенями для терапевтического развития. В канонической модели передачи сигналов GPCR активация агониста приводит к конформационным изменениям рецептора, которые впоследствии активируют гетеротримерный G-белковый комплекс путем обмена GDP на GTP в нуклеотидном карманеG-α. Активированные субъединицы Gα-GTP и Gβγ затем контролируют активность последующих эффекторных белков и распространяют сигнальный каскад 4,5. Этот сигнальный процесс существенно зависит от способности лигандов изменять трехмерную форму рецептора. Механистическое понимание того, как лиганды достигают этого, имеет решающее значение для разработки новых терапевтических средств и проектирования синтетических рецепторов и датчиков.
Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются членами семейства GPCR класса C и важны для медленных нейромодулирующих эффектов глутамата и настройки возбудимости нейронов 6,7. Среди всех GPCR GPCR класса C являются структурно уникальными в том смысле, что они функционируют как облигатные димеры. mGluRs содержат три структурных домена: домен венериной мухоловки (VFT), богатый цистеином домен (CRD) и трансмембранный домен (TMD)8. Конформационные изменения в процессе активации являются сложными и включают локальную и глобальную конформационную связь, которая распространяется на расстояние 12 нм, а также димерную кооперативность. Промежуточные конформации, временное упорядочение состояний и скорость перехода между состояниями неизвестны. Следуя конформации отдельных рецепторов в режиме реального времени, можно идентифицировать переходные промежуточные состояния и последовательность конформационных изменений во время активации. Это может быть достигнуто путем применения одномолекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии 9,10 (smFRET), как это было недавно применено для визуализации распространения конформационных изменений при активации mGluR211. Ключевым шагом в экспериментах FRET является генерация датчиков FRET путем специфической для сайта вставки донорских и акцепторных флуорофоров в интересующий белок. Стратегия включения неестественных аминокислот (UAA) была принята 12,13,14,15 для преодоления ограничений типичных технологий флуоресцентной маркировки, которые требуют создания мутантов без цистеина или вставки большой генетически закодированной метки. Это позволило наблюдать конформационную перестройку существенного компактного аллостерического линкера, который соединял лигандсвязывающий и сигнальный домены mGluR2. В этом протоколе представлено пошаговое руководство по проведению экспериментов smFRET на mGluR2, включая подход к маркировке mGluR2 с помощью UAA для присоединения флуорофоров с использованием катализируемой медью реакции циклизации азида. Более того, этот протокол описывает методологию прямого захвата мембранных белков и анализа данных. Протокол, изложенный здесь, также применим к изучению конформационной динамики других мембранных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR – это белки, которые действуют на клеточную мембрану, чтобы инициировать трансдукцию сигнала. Многие GPCR состоят из нескольких доменов, причем сигнализация зависит от совместного взаимодействия между доменами. Чтобы модулировать свойства этих мембранных рецепторов, важно понять дин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Резы Вафабахша за обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01GM140272 (для R.V.), Фондом лидерства Searle для наук о жизни в Северо-Западном университете и Чикагским биомедицинским консорциумом при поддержке фондов Searle в The Chicago Community Trust (для R.V.). B.W.L. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук (NIGMS) T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
