体 外药物递送系统和细胞之间相互作用的实验定量：临床前纳米医学评估指南
Summary
展示了使用流式细胞术对药物载体-细胞相互作用进行绝对定量的工作流程，以便更好地合理评估新型给药系统。此工作流程适用于任何类型的药物载体。
Abstract
设计药物递送系统的一个主要组成部分涉及如何放大或减弱与特定细胞类型的相互作用。例如，化疗药物可能用抗体功能化以增强与癌细胞的结合（“靶向”），或者用聚乙二醇功能化以帮助逃避免疫细胞识别（“隐形”）。即使在细胞水平上，优化药物载体的结合和摄取也是一个复杂的生物学设计问题。因此，将新承运人与细胞的相互作用程度与承运人货物一旦交付到该单元的功能功效区分开来是有价值的。
为了继续化学治疗的例子，“它与癌细胞的结合程度”与“它杀死癌细胞的程度”是一个单独的问题。后者的定量体 外 测定已经建立，通常依赖于测量活力。然而，大多数已发表的关于细胞载体相互作用的研究都是定性的或半定量的。通常，这些测量依赖于载体的荧光标记，因此以相对或任意单位报告与细胞的相互作用。然而，这项工作可以标准化，并且可以通过少量的表征实验实现绝对定量。这种绝对定量是有价值的，因为它有助于对各种药物递送系统（纳米颗粒、微粒、病毒、抗体-药物偶联物、工程治疗细胞或细胞外囊泡）进行合理的类间和类内比较。
此外，定量是后续meta分析或计算机建模方法 的 先决条件。在本文中，介绍了视频指南以及如何实现载体药物递送系统的 体外 定量的决策树，其中考虑了载体尺寸和标记方式的差异。此外，还讨论了对先进给药系统进行定量评估的进一步考虑因素。这旨在作为改善下一代医学的合理评估和设计的宝贵资源。
Introduction
药物递送结构的设计，根据它们遇到的细胞类型表现出特定的设计行为，引起了大量的研究兴趣。潜在的药物递送构建体或“载体”包括脂质制剂、纳米生长的无机物、聚合物组装体、细胞外囊泡、功能化细菌细胞或修饰的病毒。由于物理性质、表面特性或工程化学功能化（如抗体附着1，2），所有这些都可以表现出器官、组织或细胞特异性。
体外载体评估中几乎无处不在的步骤是用含有所述载药载体的悬浮液孵育细胞。孵育后，通过药物货物性能的功能读数来测量载体性能，例如转染效率或毒性。功能读数很有用，因为它们是载体有效性的下游衡量标准。然而，对于更复杂的药物递送结构，超越功能读数并单独量化载体与目标细胞的相互作用程度变得越来越重要。这有几个原因。
首先，人们对发现（并迭代改进）可以运载各种货物的“平台”承运人技术越来越感兴趣。例如，设计用于封装RNA的脂质纳米颗粒（LNP）可以将一个RNA序列交换为另一个RNA序列，几乎没有警告3。因此，为了迭代改进承运人技术，独立于货物功能量化其性能至关重要。其次，对于感兴趣的货物，功能读数可能并不简单，从而影响了快速迭代和评估载体配方的能力。虽然可以使用具有直接功能读数（例如荧光）的模型货物进行 体外 优化，但改变货物可以改变对载体4 的生物反应，因此可能不会产生代表性结果。第三，许多载体被设计为与特定细胞类型相互作用并被特定细胞类型吸收。承运人的这种 瞄准能力 可以而且应当与其 治疗性货物岗位目标的绩效区分开来。为了继续LNP的例子，RNA货物可能非常有效，但如果LNP无法与细胞结合，被内化并释放RNA，则不会观察到下游功能效应。对于旨在靶向难以转染的细胞类型（例如T细胞5）的载体来说，这可能是一个问题。相反，LNP可以非常有效地靶向，但RNA货物可能无法发挥作用。仅测量货物功能的下游检测将无法区分这两种情况，从而使载体药物输送系统的开发和优化复杂化。
在这项工作中，讨论了如何绝对量化载体 关联 。关联是一个术语，指的是实验测量的载体和细胞之间的相互作用程度。关联不区分膜结合和内化 – 载体可能被关联，因为它与细胞表面结合或因为细胞已经内化了它。关联通常作为细胞载体孵育实验的一部分进行测量。从历史上看，关联报告以任意荧光单位（通常是“中位荧光强度”或MFI）或“百分比关联”（其局限性之前已讨论过6）。简而言之，由于实验方案、流式细胞仪设置和不同载体的标记强度的差异，这些测量在实验、实验室和药物载体之间没有可比性。已经努力通过校准细胞仪来克服前者，从而将MFI的相对测量值转换为荧光的绝对定量测量值7。然而，该方法不考虑各种载体标记强度的可变性，因此不允许合理比较所选目标细胞8中的各种载体性能。
在这里，如何通过进行少量额外的表征实验来演示如何从相对的任意荧光单元实际转换为“每个细胞的载流子数”的绝对定量度量。如果需要另一个载体浓度指标（例如，每个细胞的载流子质量或每个细胞的载流子体积），则只要已完成载流子表征，就可以直接从每个细胞的载流子进行转换。为了简洁起见并避免行话，在这项工作中使用了“载体”一词来指代种类繁多的药物输送结构。这些定量技术同样适用，无论是应用于纳米工程金颗粒还是生物工程细菌。
一些事实使每个细胞从任意荧光单位转换为载体成为可能。首先，测量的荧光强度与荧光团9 （或荧光标记载体）的浓度成正比，假设荧光在仪器的检测限内，并且仪器设置相同。因此，如果已知载体的荧光和样品的荧光，则可以确定该样品中存在多少个载体，如果所有测量都是在相同的设置和条件下进行的。然而，特别是对于较小的载体，可能无法在具有相同设置的同一仪器上测量载体荧光、细胞自发荧光和细胞与载体相关的荧光。在这种情况下，还有第二个要求，可以在一台仪器上测量的荧光和另一台仪器上测量的荧光之间进行转换。为此，可以利用等效可溶性荧光染料分子（MESF）标准品9建立荧光团浓度的标准曲线来测量两种仪器上的荧光强度。然后，这允许在非细胞仪上批量测量载体荧光，该测量可以在任何大小或特征的载体上进行。当对已知浓度的载体悬浮液进行这种批量定量时，可以再次计算样品中每个细胞的载体数量。
虽然这项工作展示了测量载体关联的过程（由测量的荧光强度确定），但可以对细胞 – 载体相互作用的其他测量进行类似的协议（例如，区分内化和膜结合载体的实验方案）。此外，如果通过非荧光测定（例如，通过质谱细胞术）测量关联，则该协议将大致相同。
Protocol
Representative Results
Discussion
表征药物载体和细胞之间的相互作用在新型药物输送系统的开发中变得越来越重要。具体而言，为了能够合理评估和比较各种载体结构，所述载体与靶标和非靶细胞相互作用的性能的绝对定量至关重要。该协议描述了一种双流方法，允许任何与药物载体合作的研究人员将细胞 – 载体关联的相对半定量流式细胞术数据转换为绝对定量结果。概述的过程适用于任何类型的载体 – 小型，大型，有机，无?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC;计划拨款编号GNT1149990），澳大利亚艾滋病毒和肝炎病毒学研究中心（ACH2），以及Réjane Louise Langlois遗产的礼物。F.C.承认国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）高级首席研究奖学金（GNT1135806）的授予。图 1 和 图 2 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).
- Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
- Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).
- Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
- Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
- Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
- Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
- Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
- Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).
- Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).
- Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).
- Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
- Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
