כימות ניסיוני של אינטראקציות בין מערכות העברת תרופות ותאים במבחנה: מדריך להערכת ננו-רפואה פרה-קלינית
Summary
תהליך עבודה מודגם לכימות מוחלט של אינטראקציות בין נשא תרופה לתאים באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לאפשר הערכה רציונלית טובה יותר של מערכות אספקת תרופות חדשות. זרימת עבודה זו חלה על ספקי סמים מכל סוג שהוא.
Abstract
מרכיב מרכזי בתכנון מערכות אספקת תרופות נוגע לאופן שבו ניתן להגביר או להחליש אינטראקציות עם סוגי תאים ספציפיים. לדוגמה, כימותרפיה עשויה לתפקד עם נוגדן כדי לשפר את ההיקשרות לתאים סרטניים (“מיקוד”) או לתפקד עם פוליאתילן גליקול כדי לסייע בהתחמקות מזיהוי תאי מערכת החיסון (“התגנבות”). אפילו ברמה התאית, אופטימיזציה של קשירה וספיגה של נשא תרופה היא בעיית תכנון ביולוגית מורכבת. לפיכך, חשוב להפריד בין עוצמת האינטראקציה של מוביל חדש עם תא לבין היעילות התפקודית של מטען המוביל לאחר שנמסר לאותו תא.
כדי להמשיך את הדוגמה הכימותרפית, “עד כמה הוא נקשר לתא סרטני” היא בעיה נפרדת מ”עד כמה הוא הורג תא סרטני”. מבחנים כמותיים במבחנה עבור האחרונים מבוססים היטב ובדרך כלל מסתמכים על מדידת כדאיות. עם זאת, רוב המחקרים שפורסמו על אינטראקציות בין תאים לנשאים הם איכותניים או סמי-קוונטיים. בדרך כלל, מדידות אלה מסתמכות על תיוג פלואורסצנטי של הנשא, וכתוצאה מכך מדווחות על אינטראקציות עם תאים ביחידות יחסיות או שרירותיות. עם זאת, עבודה זו יכולה להיות סטנדרטית ולהיות כמותית לחלוטין עם מספר קטן של ניסויי אפיון. כימות מוחלט כזה הוא בעל ערך, שכן הוא מאפשר השוואות רציונליות, בין-מעמדיות ותוך-מעמדיות של מערכות אספקת תרופות שונות – ננו-חלקיקים, מיקרו-חלקיקים, וירוסים, מצומדי נוגדנים-תרופות, תאים טיפוליים מהונדסים או שלפוחיות חוץ-תאיות.
יתר על כן, כימות הוא תנאי מוקדם למטא-אנליזות הבאות או לגישות מידול סיליקו . במאמר זה מוצגים מדריכי וידאו, כמו גם עץ החלטות כיצד להשיג כימות במבחנה עבור מערכות אספקת תרופות מובילות, אשר לוקחים בחשבון הבדלים בגודל המוביל ואת מודל התיוג. בנוסף, נדונים שיקולים נוספים להערכה כמותית של מערכות מתקדמות להובלת תרופות. זה נועד לשמש משאב יקר ערך כדי לשפר את ההערכה הרציונלית ואת העיצוב עבור הדור הבא של הרפואה.
Introduction
העיצוב של מבנים לאספקת תרופות המציגים התנהגות ספציפית ומתוכננת, בהתאם לסוג התא שבו הם נתקלים, משך עניין מחקרי משמעותי. מבנים או “נשאים” פוטנציאליים של אספקת תרופות כוללים פורמולציות של שומנים, אנאורגניים שגודלו בננו, מכלולים פולימריים, שלפוחיות חוץ-תאיות, תאי חיידקים פונקציונליים או וירוסים שעברו שינוי. כל אלה יכולים להפגין ספציפיות של איברים, רקמות או תאים בשל תכונות פיזיקליות, תכונות פני שטח או פונקציות כימיות מהונדסות כגון חיבור נוגדנים 1,2.
צעד כמעט בכל מקום בהערכת נשאים במבחנה הוא דגירה של תאים עם תרחיף המכיל את המוביל העמוס בתרופות. לאחר הדגירה, ביצועי המוביל נמדדים באמצעות קריאה פונקציונלית של ביצועי מטען התרופה, לדוגמה, יעילות העברה או רעילות. קריאות פונקציונליות הן שימושיות, מכיוון שהן מהוות מדד במורד הזרם ליעילות הספק. עם זאת, עבור מבנים מורכבים יותר של אספקת תרופות, חשוב יותר ויותר להתקדם מעבר לקריאות פונקציונליות ולכמת בנפרד את מידת האינטראקציה של הנשא עם התא המעניין. יש לכך כמה סיבות.
ראשית, יש עניין גובר בגילוי (ובשיפור איטרטיבי) של טכנולוגיות “פלטפורמה”, שיכולות לשאת מגוון מטענים. לדוגמה, ננו-חלקיקי ליפידים (LNPs) שנועדו לתמצת רנ”א יכולים להחליף רצף רנ”א אחד באחר עם מעט אזהרות3. לכן, כדי לשפר באופן איטרטיבי את טכנולוגיית המוביל, זה קריטי לכמת את הביצועים שלה ללא תלות בפונקציונליות המטען. שנית, קריאות פונקציונליות עשויות להיות לא פשוטות עבור המטען המעניין, ולפגוע ביכולת לחזור ולהעריך במהירות את ניסוחי המוביל. בעוד שניתן לבצע אופטימיזציה במבחנה באמצעות מטען מודל עם קריאה פונקציונלית פשוטה (למשל, פלואורסצנציה), שינוי המטען יכול לשנות את התגובה הביולוגית למוביל4 ולפיכך לא להניב תוצאות מייצגות. שלישית, נשאים רבים מתוכננים לקיים אינטראקציה עם סוג תא מסוים ולהיקלט על ידו. יכולת מיקוד כזו של מוביל יכולה וצריכה להיות מובחנת מביצועי המטען הטיפולי שלו לאחר המיקוד. כדי להמשיך את הדוגמה של LNP, מטען RNA עשוי להיות חזק ביותר, אך אם ה-LNP אינו מסוגל להיקשר לתא, להיות מופנם ולשחרר את ה-RNA, לא תיראה השפעה תפקודית במורד הזרם. זו יכולה להיות בעיה במיוחד עבור נשאים המיועדים להתמקד בסוגי תאים קשים לשינוי, כגון תאי T5. לעומת זאת, LNP יכול לכוון ביעילות רבה, אך מטען הרנ”א עשוי שלא לתפקד. בדיקה במורד הזרם שמודדת רק את פונקציונליות המטען לא תוכל להבדיל בין שני מצבים אלה, ובכך תסבך את הפיתוח והאופטימיזציה של מערכות אספקת תרופות מובילות.
בעבודה זו, כיצד לכמת לחלוטין את איגוד המוביל נדון. אסוציאציה היא מונח המתייחס למידת האינטראקציה שנמדדה בניסוי בין נשא לתא. אסוציאציה אינה מבדילה בין קשירת ממברנה לבין הפנמה – נשא עשוי להיות קשור משום שהוא קשור לפני השטח של התא או משום שהתא הפנים אותו. אסוציאציה נמדדת בדרך כלל כחלק מניסויי דגירה של נשאים תאיים. מבחינה היסטורית, הקשר דווח ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (בדרך כלל “עוצמת פלואורסצנציה חציונית” או MFI) או כ”אחוז שיוך”, מדדים שמגבלותיהם נדונו בעבר6. בקיצור, מדידות אלה אינן ניתנות להשוואה בין ניסויים, מעבדות ונשאי תרופות בשל הבדלים בפרוטוקולי הניסוי, הגדרות ציטומטר זרימה ועוצמות הסימון של נשאים שונים. נעשו מאמצים להתגבר על הראשון על ידי כיול הציטומטר, ובכך להמיר את המידה היחסית של MFI למדד כמותי לחלוטין של פלואורסצנציה7. עם זאת, שיטה זו אינה מביאה בחשבון את השונות בעוצמת הסימון של נשאים שונים, ולכן אינה מאפשרת השוואה רציונלית של ביצועי נשאים שונים בתא יעד של בחירה8.
כאן, כיצד להמיר למעשה מיחידות פלואורסצנטיות יחסיות ושרירותיות למדד הכמותי המוחלט של “מספר הנשאים לתא” מודגם על ידי ביצוע מספר קטן של ניסויי אפיון נוספים. אם רוצים מדד אחר של ריכוז נשאים (למשל, מסת נשא לתא או נפח נשא לתא), קל להמיר מנשאים לכל תא, בתנאי שנעשה אפיון נשא. למען הקיצור וכדי להימנע מז’רגון, המילה “נשא” משמשת בעבודה זו כדי להתייחס למגוון העצום של מבני אספקת תרופות. טכניקות כימות אלה ישימות באותה מידה, בין אם הן מיושמות על חלקיק זהב מהונדס בננו או על חיידק מהונדס ביולוגית.
כמה עובדות מאפשרות המרה מיחידות פלואורסצנטיות שרירותיות לנשאים לכל תא. ראשית, עוצמת הפלואורסצנציה הנמדדת פרופורציונלית לריכוז של פלואורופור9 (או נשא המסומן באופן פלואורסצנטי), בהנחה שהפלואורסצנציה נמצאת בגבולות הגילוי של המכשיר והגדרות המכשור זהות. לפיכך, אם הפלואורסצנטיות של נשא והפלואורסצנטיות של דגימה ידועות, ניתן לקבוע כמה נשאים נמצאים בדגימה זו אם כל המדידות בוצעו באותן הגדרות ותנאים. עם זאת, במיוחד עבור נשאים קטנים יותר, ייתכן שלא ניתן יהיה למדוד פלואורסצנציה של נשאים, פלואורסצנציה של תאים ופלואורסצנטיות של תאים הקשורים לנשאים באותו מכשיר עם אותן הגדרות. במקרה זה, קיימת דרישה שנייה שתאפשר להמיר בין פלואורסצנציה נמדדת במכשיר אחד לפלואורסצנטיות מדודה במכשיר אחר. לשם כך, ניתן לקבוע עקומה סטנדרטית של ריכוז פלואורופור כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בשני המכשירים, תוך ניצול המולקולות של פלואורוכרום מסיס שווה ערך (MESF) תקן9. לאחר מכן זה מאפשר מדידה של פלואורסצנציה של המוביל בתפזורת על גבי לא ציטומטר, מדידה שניתן לבצע על נשאים בכל גודל או מאפיין. כאשר כימות בתפזורת כזה נעשה על השעיית נשא של ריכוז ידוע, ניתן לחשב שוב את מספר הנשאים לכל תא של דגימה.
בעוד שעבודה זו מדגימה את התהליך למדידת שיוך נשאים (כפי שנקבע על ידי עוצמת פלואורסצנטיות נמדדת), פרוטוקול אנלוגי יכול להתבצע עבור מדידות אחרות של אינטראקציה בין תא לנשא (למשל, פרוטוקול ניסיוני המבדיל בין נשאים מופנמים לבין נשאים הקשורים לממברנה). בנוסף, פרוטוקול זה יהיה זהה במידה רבה אם הקשר יימדד באמצעות בדיקה שאינה פלואורסצנטית (למשל, באמצעות ציטומטריה של מסה).
Protocol
Representative Results
Discussion
אפיון יחסי הגומלין בין מובילי תרופות ותאים הופך לחשוב יותר ויותר בפיתוח מערכות אספקת תרופות חדשניות. באופן ספציפי, כדי לאפשר הערכה רציונלית והשוואה של מבני נשאים שונים, כימות מוחלט של הביצועים של המוביל האמור כדי לקיים אינטראקציה עם תאי מטרה ותאי מטרה הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר מתודולוג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית האוסטרלית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC; מענק תוכנית מס’ GNT1149990), המרכז האוסטרלי לחקר וירולוגיה של HIV והפטיטיס (ACH2), כמו גם מתנה מעיזבון רג’אן לואיז לנגלואה. F.C. מכיר בפרס של מלגת מחקר בכירה של המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) (GNT1135806). איור 1 ואיור 2 נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).
- Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
- Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).
- Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
- Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
- Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
- Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
- Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
- Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).
- Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).
- Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).
- Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
- Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
