Cuantificación experimental de las interacciones entre los sistemas de administración de fármacos y las células in vitro: una guía para la evaluación preclínica de nanomedicina

Summary

Se demuestra un flujo de trabajo para la cuantificación absoluta de las interacciones fármaco-célula portadora utilizando citometría de flujo para permitir una mejor evaluación racional de nuevos sistemas de administración de fármacos. Este flujo de trabajo es aplicable a portadores de medicamentos de cualquier tipo.

Abstract

Un componente importante del diseño de sistemas de administración de fármacos se refiere a cómo amplificar o atenuar las interacciones con tipos específicos de células. Por ejemplo, un quimioterapéutico podría funcionalizarse con un anticuerpo para mejorar la unión a las células cancerosas (“dirigido”) o funcionalizarse con polietilenglicol para ayudar a evadir el reconocimiento de células inmunes (“sigilo”). Incluso a nivel celular, optimizar la unión y la absorción de un portador de fármacos es un problema complejo de diseño biológico. Por lo tanto, es valioso separar la fuerza con la que un nuevo portador interactúa con una célula de la eficacia funcional de la carga de un transportista una vez entregada a esa célula.

Para continuar con el ejemplo quimioterapéutico, “qué tan bien se une a una célula cancerosa” es un problema separado de “qué tan bien mata una célula cancerosa”. Los ensayos cuantitativos in vitro para estos últimos están bien establecidos y generalmente se basan en la medición de la viabilidad. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones publicadas sobre las interacciones célula-portador son cualitativas o semicuantitativas. En general, estas mediciones se basan en el etiquetado fluorescente del portador y, en consecuencia, informan interacciones con las células en unidades relativas o arbitrarias. Sin embargo, este trabajo puede estandarizarse y hacerse absolutamente cuantitativo con un pequeño número de experimentos de caracterización. Tal cuantificación absoluta es valiosa, ya que facilita las comparaciones racionales, inter e intraclase de varios sistemas de administración de fármacos: nanopartículas, micropartículas, virus, conjugados anticuerpo-fármaco, células terapéuticas diseñadas o vesículas extracelulares.

Además, la cuantificación es un requisito previo para los metanálisis posteriores o los enfoques de modelado in silico . En este artículo, se presentan videoguías, así como un árbol de decisión sobre cómo lograr la cuantificación in vitro para los sistemas de administración de medicamentos portadores, que tienen en cuenta las diferencias en el tamaño del portador y la modalidad de etiquetado. Además, se discuten otras consideraciones para la evaluación cuantitativa de los sistemas avanzados de administración de fármacos. Esto pretende servir como un recurso valioso para mejorar la evaluación racional y el diseño para la próxima generación de medicamentos.

Introduction

El diseño de construcciones de administración de fármacos que exhiben un comportamiento específico y diseñado dependiendo del tipo de célula que encuentren ha atraído un interés sustancial de la investigación. Las posibles construcciones o “portadores” de administración de fármacos incluyen formulaciones lipídicas, inorgánicos nanocultivados, ensamblajes poliméricos, vesículas extracelulares, células bacterianas funcionalizadas o virus modificados. Todos estos pueden exhibir especificidad de órganos, tejidos o células debido a propiedades físicas, propiedades de superficie o funcionalizaciones químicas diseñadas como la unión de anticuerpos ^1,2.

Un paso casi omnipresente en la evaluación in vitro de portadores es incubar células con una suspensión que contenga dicho portador cargado de fármaco. Después de la incubación, el rendimiento del transportista se mide a través de una lectura funcional del rendimiento de la carga de drogas, por ejemplo, la eficiencia de la transfección o la toxicidad. Las lecturas funcionales son útiles, ya que son una medida posterior de la efectividad del operador. Sin embargo, para construcciones de administración de fármacos más complejas, es cada vez más importante ir más allá de las lecturas funcionales y cuantificar por separado el grado de interacción del portador con la célula de interés. Hay algunas razones para esto.

En primer lugar, existe un creciente interés en descubrir (y mejorar iterativamente) tecnologías de transporte de “plataforma”, que pueden transportar una variedad de carga. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas (LNP) diseñadas para encapsular ARN pueden intercambiar una secuencia de ARN por otra con pocas advertencias³. Por lo tanto, para mejorar iterativamente la tecnología del transportista, es fundamental cuantificar su rendimiento independientemente de la funcionalidad de la carga. En segundo lugar, las lecturas funcionales pueden no ser sencillas para la carga de interés, comprometiendo la capacidad de iterar y evaluar rápidamente las formulaciones de los portadores. Si bien se podría realizar una optimización in vitro utilizando una carga modelo con una lectura funcional directa (por ejemplo, fluorescencia), cambiar la carga puede cambiar la respuesta biológica a un transportista⁴ y, por lo tanto, puede no producir resultados representativos. En tercer lugar, muchos portadores están diseñados para interactuar y ser absorbidos por un tipo de célula específico. Esa capacidad de fijación de objetivos de un transportista puede y debe diferenciarse del rendimiento de su carga terapéutica posterior a la focalización. Para continuar con el ejemplo de LNP, una carga de ARN podría ser extremadamente potente, pero si la LNP no puede unirse a la célula, ser internalizada y liberar el ARN, no se observará ningún efecto funcional aguas abajo. Esto puede ser un problema particularmente para los portadores destinados a atacar tipos de células difíciles de transfectar, como las células T⁵. Por el contrario, un LNP podría apuntar de manera extremadamente efectiva, pero la carga de ARN podría no funcionar. Un ensayo posterior que solo mide la funcionalidad de la carga no podrá diferenciar entre estas dos situaciones, lo que complicará el desarrollo y la optimización de los sistemas de administración de medicamentos portadores.

En este trabajo, se discute cómo cuantificar absolutamente la asociación de portadores. Asociación es un término que se refiere al grado de interacción medido experimentalmente entre un portador y una célula. La asociación no diferencia entre la unión a la membrana y la internalización: un portador puede estar asociado porque está unido a la superficie celular o porque la célula lo ha internalizado. La asociación se mide comúnmente como parte de los experimentos de incubación de portadores celulares. Históricamente, la asociación ha sido reportada ya sea en unidades fluorescentes arbitrarias (típicamente “intensidad de fluorescencia mediana” o MFI) o como “asociación porcentual”, métricas cuyas limitaciones han sido discutidas previamente⁶. En resumen, estas mediciones no son comparables entre experimentos, laboratorios y portadores de fármacos debido a las diferencias en los protocolos experimentales, la configuración del citómetro de flujo y las intensidades de etiquetado de diferentes portadores. Se han hecho esfuerzos para superar el primero calibrando el citómetro, convirtiendo así la medida relativa de MFI en una medida absolutamente cuantitativa de fluorescencia⁷. Sin embargo, este método no tiene en cuenta la variabilidad en la intensidad del etiquetado de varios portadores y, por lo tanto, no permite la comparación racional de varios rendimientos de portadores en una celda objetivo de elección⁸.

Aquí, cómo convertir prácticamente de unidades fluorescentes relativas y arbitrarias a la métrica cuantitativa absoluta del “número de portadores por célula” se demuestra realizando un pequeño número de experimentos de caracterización adicionales. Si se desea otra métrica de concentración de portador (por ejemplo, masa portadora por celda o volumen portador por celda), es fácil convertir de portadores por celda, siempre que se haya realizado la caracterización del portador. Para abreviar y evitar la jerga, la palabra “portador” se usa dentro de este trabajo para referirse a la amplia variedad de construcciones de administración de medicamentos. Estas técnicas de cuantificación son igualmente aplicables, ya sea que se apliquen a una partícula de oro de nanoingeniería o a una bacteria de bioingeniería.

Algunos hechos permiten la conversión de unidades fluorescentes arbitrarias a portadores por célula. Primero, la intensidad de fluorescencia medida es proporcional a la concentración de un fluoróforo⁹ (o un portador marcado con fluorescencia), suponiendo que la fluorescencia está dentro de los límites de detección del instrumento y los ajustes de instrumentación son los mismos. Por lo tanto, si se conocen la fluorescencia de un portador y la fluorescencia de una muestra, se puede determinar cuántos portadores están presentes en esa muestra si todas las mediciones se realizaron bajo los mismos ajustes y condiciones. Sin embargo, especialmente para portadores más pequeños, puede que no sea posible medir la fluorescencia del portador, la autofluorescencia celular y la fluorescencia asociada a la célula con portadores en el mismo instrumento con la misma configuración. En este caso, existe un segundo requisito para que sea posible convertir entre la fluorescencia medida en un instrumento y la fluorescencia medida en otro. Para ello, se puede establecer una curva estándar de concentración de fluoróforos para medir la intensidad de fluorescencia en ambos instrumentos, aprovechando^{el estándar 9} de Moléculas de fluorocromo soluble equivalente (MESF). Esto permite la medición de la fluorescencia del portador a granel en un no citómetro, una medición que se puede hacer en portadores de cualquier tamaño o característica. Cuando dicha cuantificación a granel se realiza en una suspensión portadora de concentración conocida, se puede calcular una vez más el número de portadores por celda de una muestra.

Si bien este trabajo demuestra el proceso para medir la asociación de portadores (según lo determinado por la intensidad de fluorescencia medida), se podría realizar un protocolo análogo para otras medidas de interacción célula-portador (por ejemplo, un protocolo experimental que diferencie los portadores internalizados y unidos a la membrana). Además, este protocolo sería en gran medida el mismo si la asociación se midiera a través de un ensayo no fluorescente (por ejemplo, a través de citometría de masas).

Protocol

1. Elegir la transmisión adecuada Siga el árbol de decisión descrito en la Figura 1 para determinar el mejor flujo de trabajo (flujo) (Figura 2) para la configuración experimental utilizada. Consulte la discusión para obtener más comentarios sobre esta elección de corriente. Si sigue el flujo del citómetro, continúe con los pasos 2.1.1-2.2.7. Si sigue la transmisión masiva, continúe con los pasos 3.1.1.1-3.1.5.7.</…

Representative Results

Como se discutió anteriormente, los diferentes tipos de portadores de fármacos requieren el uso de diferentes técnicas para la cuantificación absoluta de la asociación célula-portador. Por ejemplo, las partículas de núcleo de poli(ácido metacrílico) estabilizado con disulfuro (PMASH) de 633 nm son lo suficientemente grandes y densas para su detección con un citómetro de flujo sensible. Como tal, estas partículas se marcaron fluorescentemente, luego se cerraron y se contaron utilizando la dispersi?…

Discussion

La caracterización de las interacciones entre los portadores de fármacos y las células es cada vez más importante en el desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Específicamente, para permitir la evaluación racional y la comparación de varias construcciones de portadores, la cuantificación absoluta del rendimiento de dicho portador para interactuar con las células objetivo y fuera del objetivo es crítica. Este protocolo describe una metodología de dos flujos que permite a cualquier investi…

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard