Eksperimentell kvantifisering av interaksjoner mellom legemiddelleveringssystemer og celler in vitro: En veiledning for preklinisk nanomedisinevaluering

Summary

En arbeidsflyt er demonstrert for absolutt kvantifisering av legemiddelbærer-celleinteraksjoner ved bruk av flowcytometri for å muliggjøre bedre rasjonell evaluering av nye legemiddelleveringssystemer. Denne arbeidsflyten gjelder for legemiddelbærere av alle typer.

Abstract

En viktig komponent i utformingen av legemiddelleveringssystemer gjelder hvordan man forsterker eller demper interaksjoner med bestemte celletyper. For eksempel kan en kjemoterapeutisk bli funksjonalisert med et antistoff for å forbedre bindingen til kreftceller (“målretting”) eller funksjonalisert med polyetylenglykol for å unngå immuncellegjenkjenning (“stealth”). Selv på mobilnivå er optimalisering av binding og opptak av en legemiddelbærer et komplekst biologisk designproblem. Dermed er det verdifullt å skille hvor sterkt en ny bærer interagerer med en celle fra den funksjonelle effekten av en transportørs last når den er levert til den cellen.

For å fortsette det kjemoterapeutiske eksemplet, “hvor godt det binder seg til en kreftcelle” er et eget problem fra “hvor godt det dreper en kreftcelle”. Kvantitative in vitro-analyser for sistnevnte er veletablerte og er vanligvis avhengige av å måle levedyktighet. Imidlertid er mest publisert forskning på cellebærerinteraksjoner kvalitativ eller semikvantitativ. Vanligvis er disse målingene avhengige av fluorescerende merking av bæreren og rapporterer følgelig interaksjoner med celler i relative eller vilkårlige enheter. Dette arbeidet kan imidlertid standardiseres og gjøres helt kvantitativt med et lite antall karakteriseringseksperimenter. Slik absolutt kvantifisering er verdifull, da det letter rasjonelle, inter- og intra-klasse sammenligninger av ulike legemiddelleveringssystemer-nanopartikler, mikropartikler, virus, antistoff-legemiddelkonjugater, konstruerte terapeutiske celler eller ekstracellulære vesikler.

Videre er kvantifisering en forutsetning for senere metaanalyser eller i silikomodelleringsmetoder . I denne artikkelen presenteres videoguider, samt et beslutningstre for hvordan man oppnår in vitro-kvantifisering for bærermedisinleveringssystemer, som tar hensyn til forskjeller i bærerstørrelse og merkingsmodalitet. I tillegg drøftes ytterligere vurderinger for kvantitativ vurdering av avanserte legemiddelleveringssystemer. Dette er ment å tjene som en verdifull ressurs for å forbedre rasjonell evaluering og design for neste generasjon medisin.

Introduction

Utformingen av legemiddelleveringskonstruksjoner som viser spesifikk, designet oppførsel avhengig av hvilken celletype de møter, har tiltrukket seg betydelig forskningsinteresse. Potensielle legemiddelleveringskonstruksjoner eller “bærere” inkluderer lipidformuleringer, nano-dyrkede uorganiske stoffer, polymere forsamlinger, ekstracellulære vesikler, funksjonaliserte bakterieceller eller modifiserte virus. Alle disse kan utvise organ-, vevs- eller cellespesifisitet på grunn av fysiske egenskaper, overflateegenskaper eller konstruerte kjemiske funksjonaliseringer som antistofffeste ^1,2.

Et nesten allestedsnærværende trinn i in vitro-bærerevaluering er å inkubere celler med en suspensjon som inneholder den legemiddelbelastede bæreren. Etter inkubasjon måles bærerens ytelse via en funksjonell avlesning av legemiddellastens ytelse, for eksempel transfeksjonseffektivitet eller toksisitet. Funksjonelle avlesninger er nyttige, da de er et nedstrøms mål på transportørens effektivitet. For mer komplekse legemiddelleveringskonstruksjoner er det imidlertid stadig viktigere å bevege seg utover funksjonelle avlesninger og separat kvantifisere graden av bærerinteraksjon med cellen av interesse. Det er noen grunner til dette.

For det første er det økende interesse for å oppdage (og iterativt forbedre) “plattform” transportørteknologier, som kan bære en rekke last. For eksempel kan lipid nanopartikler (LNPs) designet for å innkapsle RNA bytte en RNA-sekvens for en annen med få advarsler³. For å iterativt forbedre transportørteknologien er det derfor avgjørende å kvantifisere ytelsen uavhengig av lastfunksjonaliteten. For det andre kan funksjonelle avlesninger ikke være enkle for lasten av interesse, noe som kompromitterer evnen til raskt å iterere og evaluere transportørformuleringer. Mens man kan utføre in vitro-optimalisering ved hjelp av en modelllast med en enkel funksjonell avlesning (for eksempel fluorescens), kan endring av lasten endre den biologiske responsen til en bærer⁴ og kan dermed ikke gi representative resultater. For det tredje er mange bærere designet for å samhandle med og bli tatt opp av en bestemt celletype. En slik målrettingsevne for en transportør kan og bør differensieres fra ytelsen til den terapeutiske lastpostmålrettingen. For å fortsette LNP-eksemplet kan en RNA-last være ekstremt kraftig, men hvis LNP ikke klarer å binde seg til cellen, internaliseres og frigjøre RNA, vil ingen nedstrøms funksjonell effekt bli observert. Dette kan være et problem spesielt for bærere som er ment å målrette mot celletyper som er vanskelige å transfektere, for eksempel T-celler⁵. Omvendt kan en LNP målrette ekstremt effektivt, men RNA-lasten fungerer kanskje ikke. En nedstrøms analyse som bare måler lastfunksjonalitet, vil ikke kunne skille mellom disse to situasjonene, og dermed komplisere utviklingen og optimaliseringen av transportørens legemiddelleveringssystemer.

I dette arbeidet diskuteres hvordan man absolutt kvantifiserer transportørforening . Forening er et begrep som refererer til den eksperimentelt målte graden av interaksjon mellom en bærer og en celle. Assosiasjon skiller ikke mellom membranbinding og internalisering – en bærer kan være assosiert fordi den er bundet til celleoverflaten eller fordi cellen har internalisert den. Forening måles vanligvis som en del av cellebærerinkubasjonseksperimenter. Historisk har assosiasjon blitt rapportert enten i vilkårlige fluorescerende enheter (typisk “median fluorescensintensitet” eller MFI) eller som “prosentforening”, beregninger hvis begrensninger tidligere har blitt diskutert⁶. Kort sagt, disse målingene er ikke sammenlignbare mellom eksperimenter, laboratorier og legemiddelbærere på grunn av forskjeller i eksperimentelle protokoller, flowcytometerinnstillinger og merkingsintensitetene til forskjellige bærere. Det er gjort anstrengelser for å overvinne førstnevnte ved å kalibrere cytometeret, og dermed konvertere det relative målet for MFI til et absolutt kvantitativt mål for fluorescens⁷. Denne metoden tar imidlertid ikke hensyn til variabiliteten i merkingsintensiteten til forskjellige bærere, og tillater dermed ikke den rasjonelle sammenligningen av ulike bærerprestasjoner i en målcelle av valg⁸.

Her demonstreres hvordan man praktisk talt konverterer fra relative, vilkårlige fluorescerende enheter til den absolutte kvantitative metriske av “antall bærere per celle” ved å utføre et lite antall ytterligere karakteriseringseksperimenter. Hvis en annen beregning av bærerkonsentrasjon er ønsket (f.eks. Bærermasse per celle eller bærervolum per celle), er det enkelt å konvertere fra bærere per celle, forutsatt at bærerkarakterisering er gjort. For korthet og for å unngå sjargong, brukes ordet “bærer” i dette arbeidet for å referere til det store utvalget av legemiddelleveringskonstruksjoner. Disse kvantifiseringsteknikkene er like anvendelige, enten de brukes på en nanokonstruert gullpartikkel eller en biokonstruert bakterie.

Noen få fakta muliggjør konvertering fra vilkårlige fluorescerende enheter til bærere per celle. For det første er den målte fluorescensintensiteten proporsjonal med konsentrasjonen av en fluorofor⁹ (eller en fluorescerende merket bærer), forutsatt at fluorescensen er innenfor instrumentets deteksjonsgrenser og instrumenteringsinnstillingene er de samme. Således, hvis fluorescensen til en bærer og fluorescensen til en prøve er kjent, kan man bestemme hvor mange bærere som er tilstede i den prøven hvis alle målingene ble utført under de samme innstillingene og forholdene. Imidlertid, spesielt for mindre bærere, kan det ikke være mulig å måle bærerfluorescens, celle autofluorescens og celle-assosiert-med-bærere fluorescens på samme instrument med de samme innstillingene. I dette tilfellet er det et annet krav for å gjøre det mulig å konvertere mellom målt fluorescens på ett instrument og målt fluorescens på et annet. For å gjøre dette kan en standardkurve for fluoroforkonsentrasjon etableres for å måle fluorescensintensiteten på begge instrumentene, og dra nytte av molekylene av ekvivalent løselig fluorokrom (MESF) standard⁹. Dette tillater deretter måling av bærerfluorescensen i bulk på et ikke-cytometer, en måling som kan gjøres på bærere av enhver størrelse eller egenskap. Når slik bulkkvantifisering gjøres på en bærersuspensjon av kjent konsentrasjon, kan antall bærere per celle i en prøve igjen beregnes.

Selv om dette arbeidet demonstrerer prosessen for måling av bærerassosiasjon (som bestemt av målt fluorescensintensitet), kan en analog protokoll utføres for andre målinger av cellebærerinteraksjon (f.eks. En eksperimentell protokoll som skiller internaliserte og membranbundne bærere). I tillegg ville denne protokollen i stor grad være den samme hvis foreningen ble målt gjennom en ikke-fluorescerende analyse (for eksempel gjennom massecytometri).

Protocol

1. Velge riktig strøm Følg beslutningstreet som er beskrevet i figur 1 , for å finne den beste arbeidsflyten (strøm) (figur 2) for det eksperimentelle oppsettet som brukes. Se diskusjonen for ytterligere kommentarer til dette valget av strøm. Hvis du følger cytometerstrømmen, fortsett med trinn 2.1.1-2.2.7. Hvis du følger Bulk Stream, fortsetter du med trinn 3.1.1.1-3.1.5.7. <p class="jove_content biglegend"…

Representative Results

Som diskutert tidligere, krever forskjellige legemiddelbærertyper bruk av forskjellige teknikker for absolutt kvantifisering av cellebærerassosiasjon. For eksempel er 633 nm disulfidstabilisert poly (metakrylsyre) (PMASH) kjerneskallpartikler store og tette nok til deteksjon ved bruk av et følsomt flowcytometer. Som sådan ble disse partiklene merket fluorescerende, deretter inngjerdet og talt ved hjelp av sidevinklet lysspredning (SALS, analog med SSC), samt riktig fluorescerende kanal (<strong class="xfig…

Discussion

Karakterisering av samspillet mellom legemiddelbærere og celler blir stadig viktigere i utviklingen av nye legemiddelleveringssystemer. Spesielt for å tillate rasjonell evaluering og sammenligning av ulike bærerkonstruksjoner, er absolutt kvantifisering av ytelsen til transportøren til å samhandle med mål- og off-target-celler kritisk. Denne protokollen beskriver en tostrømsmetode som gjør det mulig for enhver forsker som arbeider med en legemiddelbærer å konvertere relative, semikvantitative flowcytometridata …

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard