Experimentell kvantifiering av interaktioner mellan läkemedelsleveranssystem och celler in vitro: En guide för preklinisk nanomedicinsk utvärdering

Summary

Ett arbetsflöde demonstreras för absolut kvantifiering av läkemedelsbärar-cellinteraktioner med hjälp av flödescytometri för att möjliggöra bättre rationell utvärdering av nya drug delivery-system. Detta arbetsflöde är tillämpligt på läkemedelsbärare av vilken typ som helst.

Abstract

En viktig komponent i utformningen av drug delivery-system handlar om hur man förstärker eller dämpar interaktioner med specifika celltyper. Till exempel kan en kemoterapeutisk funktionaliseras med en antikropp för att förbättra bindningen till cancerceller (“inriktning”) eller funktionaliseras med polyetylenglykol för att undvika immuncellsigenkänning (“stealth”). Även på cellnivå är optimering av bindningen och upptaget av en läkemedelsbärare ett komplext biologiskt designproblem. Således är det värdefullt att skilja hur starkt en ny bärare interagerar med en cell från den funktionella effekten av en bärares last när den väl levererats till den cellen.

För att fortsätta det kemoterapeutiska exemplet är “hur väl det binder till en cancercell” ett separat problem från “hur bra det dödar en cancercell”. Kvantitativa in vitro-analyser för de senare är väl etablerade och är vanligtvis beroende av att mäta viabiliteten. Den mesta publicerade forskningen om cellbärarinteraktioner är dock kvalitativ eller semikvantitativ. I allmänhet är dessa mätningar beroende av fluorescerande märkning av bäraren och rapporterar följaktligen interaktioner med celler i relativa eller godtyckliga enheter. Detta arbete kan dock standardiseras och göras absolut kvantitativt med ett litet antal karakteriseringsexperiment. Sådan absolut kvantifiering är värdefull, eftersom den underlättar rationella, inter- och intraklassjämförelser av olika läkemedelsleveranssystem-nanopartiklar, mikropartiklar, virus, antikropps-läkemedelskonjugat, konstruerade terapeutiska celler eller extracellulära vesiklar.

Dessutom är kvantifiering en förutsättning för efterföljande metaanalyser eller in silico-modelleringsmetoder . I den här artikeln presenteras videoguider, liksom ett beslutsträd för hur man uppnår in vitro-kvantifiering för carrier drug delivery-system, som tar hänsyn till skillnader i bärarstorlek och märkningsmodalitet. Dessutom diskuteras ytterligare överväganden för kvantitativ bedömning av avancerade drug delivery-system. Detta är avsett att fungera som en värdefull resurs för att förbättra rationell utvärdering och design för nästa generations medicin.

Introduction

Utformningen av drug delivery-konstruktioner som uppvisar specifikt, designat beteende beroende på vilken celltyp de möter har väckt stort forskningsintresse. Potentiella läkemedelsleveranskonstruktioner eller “bärare” inkluderar lipidformuleringar, nanoodlade oorganiska ämnen, polymera sammansättningar, extracellulära vesiklar, funktionaliserade bakterieceller eller modifierade virus. Alla dessa kan uppvisa organ-, vävnads- eller cellspecificitet på grund av fysikaliska egenskaper, ytegenskaper eller konstruerade kemiska funktionaliseringar såsom antikroppsfäste ^1,2.

Ett nästan allestädes närvarande steg i in vitro-bärarutvärdering är att inkubera celler med en suspension som innehåller nämnda läkemedelsbelastade bärare. Efter inkubation mäts bärarprestanda via en funktionell avläsning av läkemedelslastens prestanda, till exempel transfektionseffektivitet eller toxicitet. Funktionella avläsningar är användbara, eftersom de är ett nedströms mått på bärarens effektivitet. För mer komplexa läkemedelsleveranskonstruktioner blir det emellertid allt viktigare att gå bortom funktionella avläsningar och separat kvantifiera graden av bärarinteraktion med cellen av intresse. Det finns några anledningar till detta.

För det första ökar intresset för att upptäcka (och iterativt förbättra) “plattformsteknik”, som kan bära en mängd olika laster. Till exempel kan lipidnanopartiklar (LNP) som är utformade för att kapsla in RNA byta ut en RNA-sekvens mot en annan med få försiktighetsåtgärder³. För att iterativt förbättra bärartekniken är det därför viktigt att kvantifiera dess prestanda oberoende av lastfunktionaliteten. För det andra kanske funktionella avläsningar inte är enkla för lasten av intresse, vilket äventyrar förmågan att snabbt iterera och utvärdera bärarformuleringar. Medan man kan utföra in vitro-optimering med hjälp av en modelllast med en enkel funktionell avläsning (till exempel fluorescens), kan byte av last ändra det biologiska svaret på en bärare⁴ och kan därför inte ge representativa resultat. För det tredje är många bärare utformade för att interagera med och tas upp av en specifik celltyp. En sådan målinriktningsförmåga hos ett transportföretag kan och bör särskiljas från prestandan hos dess terapeutiska laststolpeinriktning. För att fortsätta LNP-exemplet kan en RNA-last vara extremt potent, men om LNP inte kan binda till cellen, internaliseras och frigöra RNA kommer ingen nedströms funktionell effekt att observeras. Detta kan vara ett problem särskilt för bärare som är avsedda att rikta in sig på svårtransfekta celltyper, såsom T-celler⁵. Omvänt kan en LNP rikta in sig extremt effektivt, men RNA-lasten kanske inte fungerar. En nedströmsanalys som bara mäter lastfunktionalitet kommer inte att kunna skilja mellan dessa två situationer, vilket komplicerar utvecklingen och optimeringen av carrier drug delivery-system.

I detta arbete diskuteras hur man absolut kvantifierar bärarförening . Association är en term som hänvisar till den experimentellt uppmätta graden av interaktion mellan en bärare och en cell. Association skiljer inte mellan membranbindning och internalisering – en bärare kan vara associerad eftersom den är bunden till cellytan eller för att cellen har internaliserat den. Associering mäts vanligtvis som en del av cellbärarinkubationsexperiment. Historiskt sett har association rapporterats antingen i godtyckliga fluorescerande enheter (vanligtvis “median fluorescensintensitet” eller MFI) eller som “procentassociation”, mätvärden vars begränsningar tidigare har diskuterats⁶. Kort sagt, dessa mätningar är inte jämförbara mellan experiment, laboratorier och läkemedelsbärare på grund av skillnader i experimentella protokoll, flödescytometerinställningar och märkningsintensiteter hos olika bärare. Ansträngningar har gjorts för att övervinna den förra genom att kalibrera cytometern och därigenom omvandla det relativa måttet på MFI till ett absolut kvantitativt mått på fluorescens⁷. Denna metod tar emellertid inte hänsyn till variationen i märkningsintensiteten hos olika bärare och tillåter således inte en rationell jämförelse av olika bärarprestanda i en målcell som valts⁸.

Här, hur man praktiskt konverterar från relativa, godtyckliga fluorescerande enheter till det absoluta kvantitativa måttet för “antal bärare per cell” demonstreras genom att utföra ett litet antal ytterligare karakteriseringsexperiment. Om ett annat mått på bärarkoncentration önskas (t.ex. bärarmassa per cell eller bärarvolym per cell) är det enkelt att konvertera från bärare per cell, förutsatt att bärarkarakterisering har gjorts. För korthet och för att undvika jargong används ordet “bärare” inom detta arbete för att hänvisa till det stora sortimentet av läkemedelsleveranskonstruktioner. Dessa kvantifieringstekniker är lika tillämpliga, oavsett om de tillämpas på en nanokonstruerad guldpartikel eller en biokonstruerad bakterie.

Några fakta möjliggör omvandling från godtyckliga fluorescerande enheter till bärare per cell. För det första är den uppmätta fluorescensintensiteten proportionell mot koncentrationen av en fluorofor⁹ (eller en fluorescerande märkt bärare), förutsatt att fluorescensen ligger inom instrumentets detektionsgränser och instrumenteringsinställningarna är desamma. Således, om fluorescensen hos en bärare och fluorescensen hos ett prov är kända, kan man bestämma hur många bärare som finns i det provet om alla mätningar utfördes under samma inställningar och förhållanden. Men särskilt för mindre bärare kanske det inte är möjligt att mäta bärarfluorescens, cellautofluorescens och cellassocierad fluorescens med bärare på samma instrument med samma inställningar. I detta fall finns det ett andra krav på att göra det möjligt att konvertera mellan uppmätt fluorescens på ett instrument och uppmätt fluorescens på ett annat. För att göra detta kan en standardkurva för fluoroforkoncentrationen fastställas för att mäta fluorescensintensiteten på båda instrumenten och dra nytta av molekylerna av ekvivalent löslig fluorokrom (MESF) standard⁹. Detta möjliggör sedan mätning av bärarfluorescensen i bulk på en icke-cytometer, en mätning som kan göras på bärare av vilken storlek eller egenskap som helst. När en sådan bulkkvantifiering görs på en bärarsuspension med känd koncentration kan antalet bärare per cell i ett prov återigen beräknas.

Medan detta arbete visar processen för att mäta bärarassociation (som bestäms av uppmätt fluorescensintensitet), kan ett analogt protokoll utföras för andra mått på cellbärarinteraktion (t.ex. ett experimentellt protokoll som skiljer internaliserade och membranbundna bärare). Dessutom skulle detta protokoll vara i stort sett detsamma om associationen mättes genom en icke-fluorescerande analys (till exempel genom masscytometri).

Protocol

1. Välja lämplig ström Följ beslutsträdet som beskrivs i bild 1 för att fastställa det bästa arbetsflödet (ström) (bild 2) för den experimentella konfiguration som används. Se diskussionen för ytterligare kommentarer om detta val av ström. Om du följer cytometerströmmen fortsätter du med steg 2.1.1-2.2.7. Om du följer massströmmen fortsätter du med stegen 3.1.1.1–3.1.5.7. <p class="jove_content…

Representative Results

Som diskuterats tidigare kräver olika läkemedelsbärartyper användning av olika tekniker för absolut kvantifiering av cellbärarassociation. Till exempel är 633 nm disulfidstabiliserade poly(metakrylsyra) (PMASH) kärnskalpartiklar stora och täta nog för detektion med användning av en känslig flödescytometer. Som sådan märktes dessa partiklar fluorescerande, sedan gated och räknades med hjälp av sidovinkelljusspridning (SALS, analogt med SSC), liksom lämplig fluorescerande kanal (<strong class="…

Discussion

Att karakterisera interaktionerna mellan läkemedelsbärare och celler blir allt viktigare i utvecklingen av nya drug delivery-system. Specifikt, för att möjliggöra rationell utvärdering och jämförelse av olika bärarkonstruktioner, är absolut kvantifiering av bärarens prestanda för att interagera med mål- och off-target-celler kritisk. Detta protokoll beskriver en tvåströmsmetodik som gör det möjligt för alla forskare som arbetar med en läkemedelsbärare att konvertera relativa, semikvantitativa flödesc…

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard