Summary
我们提出了小鼠胚胎培养和成像的详细方案,可实现心脏祖细胞的3D +时间成像。该视频工具包解决了成功进行实时成像所需的关键技能,否则很难从纯文本出版物中获得。
Abstract
心脏发育的第一步意味着细胞行为和分化的剧烈变化。虽然对固定胚胎的分析允许在静止快照中详细研究特定的发育阶段,但实时成像通过在胚胎发育过程中成像来捕获动态形态发生事件,例如细胞迁移、形状变化和分化。这补充了固定分析,并扩展了对胚胎发生过程中器官如何发育的理解。尽管具有优势,但由于其技术挑战,实时成像很少用于小鼠模型。早期小鼠胚胎在 离体 培养时很敏感,需要有效处理。为了促进实时成像在小鼠发育研究中的更广泛应用,本文提出了一种双光子实时显微镜的详细方案,该协议允许在小鼠胚胎中长期采集。除方案外,还提供了有关胚胎处理和培养优化的提示。这将有助于了解早期小鼠器官发生的关键事件,增强对心血管祖细胞生物学的理解。
Introduction
心脏在胚胎发生早期形成,开始向整个胚胎输送营养物质,同时继续发育1。在小鼠胚胎中,原肠胚形成开始一天半后,一个基本的心脏器官在前极2,3处组装。到早期条纹(ES)阶段,外胚层中的心脏祖细胞通过原始条纹进入新生的中胚层4,5,6并开始迁移到前极,在那里它们分化形成原始心脏管。在整个过程中,除了迁移7之外,早期心脏祖细胞还经历细胞重排,形状转换和分化(图1)。
近一个世纪以来,早期的心脏祖细胞因其同时分化和构建功能器官的非凡能力而吸引了研究人员。在过去的二十年中,克隆分析和条件敲除模型表明,早期心脏发育涉及高度动态过程中的不同细胞来源8,9,10。然而,原始心脏管的3D结构及其形态发生的动态性质使其研究具有挑战性(图1),我们远未了解其全部复杂性11。
为了研究这些动态细胞过程,实时成像方法现在提供了前所未有的细节7,12,13,14。在小鼠模型中,实时方法是询问静态分析难以解决的发展主题的关键7,13,15。虽然长期离体培养和强大的显微镜装置正在快速发展16,17,但很少有研究人员具备成功对活胚胎进行成像的专业知识。尽管纸质出版物提供了足够的技术细节来重现实时成像实验,但如果没有视觉示例或点对点帮助,一些技能和技巧很难掌握。为了加速这一学习过程并在实验室中推广实时成像的使用,我们组装了一个视频协议(图2),该协议收集了对原肠胚小鼠胚胎进行实时成像的必要技能。
图1:小鼠胚胎中心脏祖细胞的早期分化,从原肠胚形成开始到原始心脏管形成之前的阶段。 心脏祖细胞在原肠胚形成开始后不久进入中胚层,迁移到胚胎的另一侧。形态和胚胎日(E)阶段写在图表的顶部。虚线箭头描绘了原肠胚形成过程中原始心脏管祖细胞的迁移轨迹。这个数字改编自11。缩写:ES = 早期连胜;MS = 中间条纹;EHF = 早期头部折叠。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:早期心脏祖细胞实时成像的工作流程图。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
所有动物程序均由CNIC动物实验伦理委员会,马德里共同体批准(参考PROEX 220/15),并符合欧盟指令2010/63EU和关于保护用于实验和其他科学目的的动物的建议2007/526 / EC,根据Real Decreto 1201/2005在西班牙法律中强制执行。
该方案包括使用来自荧光转基因小鼠系的两名雄性报告NOTCH活性Tg(CBF:H2BVenus,+)18。有关本协议中使用的材料、动物和设备的详细信息,请参阅 材料表 。
1. 工具和支架定制
- 切割1厘米长的钨丝片,并使用任何可用的简单方法将它们锐化至0.02-0.05毫米直径,例如,将钨丝的尖端浸入饱和亚硝酸钠溶液19中。
- 准备弯头玻璃毛细管。
- 将标准 1.0 毫米玻璃毛细管的中点放在本生打火机上 3-6 秒,从两端缓慢拉动,直到毛细管变薄且有弹性。此时,将毛细管分成两半并短暂加热,以产生距尖端 2 厘米的 90° 弯曲。
- 看到一块长约7毫米,宽约4毫米,厚2毫米的聚甲基丙烯酸甲酯(图3D)。
注意:聚甲基丙烯酸甲酯板材可以从回收的实验室设备中获得,也可以订购新的。 - 使用台虎钳握住甲基丙烯酸酯片。接下来,在整个工件上横向钻定制尺寸的孔(图 3D)。
注意:通常,E6.5至E7.5小鼠胚胎需要使用直径为0.2-0.5毫米的钻头。- 缓慢旋转钻头,同时施加低但恒定的压力。如果钻头在支架内断裂,请丢弃该工件,因为金属无法取出。
- 使用精细锉刀平滑支架的边缘并调整其大小。此外,在支架的边缘创建一个温和的斜坡,以促进胚胎定位(图3D)。
- 将完成的支架放入装有蒸馏水的盘子中冲洗。
- 在体视显微镜下检查支架,查看孔中是否含有钻孔粉尘。如果有灰尘,请使用钨针将其清除。
- 要对支架进行消毒,请将其放入装满蒸馏水的锥形管中,并以至少20 W的功率输出对其进行超声处理20分钟。
2. 培养基制备
- 要热灭活补体系统,请将两个500μL等分试样的商业或自制20大鼠血清在56°C下放置30 分钟。
注意:有关如何制备大鼠血清的详细方案,请参阅21。 - 在细胞培养罩中,准备两个等分试样的培养基,用于在显微镜下培养胚胎。对于每种,混合 490 μL 用于活细胞成像的 DMEM、500 μL 灭活大鼠血清和 10 μL 青霉素-链霉素,以获得终浓度为 50 μg/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素22。
注意:培养基的体积取决于要培养的胚胎的时间和数量。根据经验,在E7.0胚胎中,最佳生长要求每个胚胎每天至少200μL。 - 使用2mL注射器,通过0.22μm孔径的膜过滤器将培养基过滤到新管中,并将其盖子打开在37°C和7%CO2 的细胞培养箱中1小时,然后胚胎培养23。
- 通过将以下内容添加到补充有 L-谷氨酰胺瓶的 500 mL DMEM 中来制备解剖培养基:50 mL 胎牛血清、10 mL 25 mM HEPES-NaOH (pH 7.2) 和 10 mL 青霉素和链霉素 (50 mg/mL)。
- 接下来,将其分成50mL等分试样,将三个等分试样放入37°C浴中,其余部分在4°C下储存长达3个月。
3. 胚胎解剖
- 对E6.75-E7.5怀孕的小鼠实施安乐死。
- 取出子宫并将其放在干燥干净的纸巾上。然后,切开子宫,从中小侧插入细剪刀的尖端,然后沿着刀片滑动以露出蜕膜并将它们转移到解剖介质中。有关详细协议,请参阅24。
- 解剖胚胎,保持胎外胎盘完整(图3A,B)。有关详细的解剖方法,请参阅25。
- 然后,剥离Reichert的膜,将其的一部分留在胚胎外区域(图3B)。
注意:细镊子对于此步骤至关重要。没有经验的用户可以在2%琼脂糖凝胶包被的培养皿上解剖胚胎,以避免将镊子的尖端弯曲到培养皿表面(图3C)。 - 为了保持解剖介质温暖,每10分钟更换一次。此外,以3-4个为一组解剖蜕蜕,其余部分保存在放置在37°C浴中的解剖培养基中。立即将解剖的胚胎放入培养基中。
- 使用荧光立体显微镜选择具有所需荧光特征的胚胎,并将它们放入细胞培养箱中含有培养基的管中。
- 如果胚胎处于E6.5至E7.0阶段,请关闭盖子,让胚胎在成像前恢复2小时。
注意:E6.5至E7.0胚胎是敏感的。它们也可以直接放置在显微镜下,但预培养允许选择从解剖中恢复最好的那些,从而增加成功的机会。
4. 显微镜制备
- 打开所有显微镜组件,包括激光器、计算机和软件。打开温度控制器并提前3小时设置为37°C以确保平衡。
- 如果使用浸入式检测物镜,请使用无残留的一次性湿巾进行清洁。使用60毫米培养皿将物镜尖端浸入双蒸水中,直到采集开始。
- 打开 CO2 控制器并将其设置为 7%。
- 将一滴高真空硅脂滴在带有玻璃盖玻片底部(直径 14 毫米)的 35 毫米培养皿上,将支架放在液滴顶部,然后轻轻按压以使其固定。
- 在体视显微镜下,加入培养基以填充培养皿的玻璃底部分。这样做时,将气流对准支架的孔,以防止在其中形成气泡。
- 如果气泡仍然存在,请使用步骤1.2中制备的玻璃毛细管,连接到带有吹嘴的硅胶管,轻轻地吸出气泡。
注意: 毛细管的弯头端便于通过孔进入。
5. 胚胎安装
- 将留在培养箱中恢复的2-3个胚胎转移到带有支架的培养皿中。将其余的留在培养箱中作为备份。
- 使用一对镊子和锥形钨针将胚胎放在孔中。用针头通过外胎盘锥钩住胚胎并将其插入大小匹配的孔中。要固定胚胎,请将锥体旋转90-120°,以使Reichter的膜粘附在孔壁上(图3C)。有关替代说明,请参阅26。
- 小心地将装有胚胎和支架的培养皿移动到显微镜板上(图3F,G)。
注意:如果不稳定移动,胚胎可以从支架中移出。 - 降低物镜,直到在中物镜界面形成液体弯月面。
- 在显微镜双筒望远镜下使用透射光定位胚胎并将胚胎置于焦点中。
- 安装培养室并使用胶带将其密封在物镜周围(图3F)。
- 使用显微镜控制软件上的实时捕获,调整激光输出和增益水平。
注意:对于绿色荧光蛋白(GFP)和Tdtomato报告基因的双光子采集,本协议中使用了980nm处的30%输出激光功率和未去扫描探测器上的70%增益(图3G)。 - 为避免蒸发,将石蜡油缓慢滴在物镜上,用石蜡油覆盖培养基。
注意:这是可以在支架中安装其他胚胎的最后一点。一旦被石蜡油覆盖,就必须清洁支架并更换介质才能这样做。有关其他安装方法,请参见27。
6. 图像采集
- 设置延时摄影录制。设置5-10分钟的时间间隔,堆叠之间的z空间为3-5μm。在z-stack顶部留出一个空白区域以预测胚胎生长,至少50μm,每小时增加30μm,采集不会受到监督。
- 如果可用,请启用“自动保存”选项以允许从个人计算机监督采集,以便根据需要调整 z 堆栈大小以适应焦点内的感兴趣区域。
图 3:实时成像工具和设置 。 (A)在体视显微镜下用琼脂糖包被的培养皿解剖小鼠胚胎。(B)解剖小鼠胚胎以进行活体成像的步骤图。(C)胚胎在支架中的定位。(四)胚胎架的设计和特点。(F)培养箱室周围有浸没物镜。(G) 延时采集的最终设置图。比例尺 = 500 μm (A)。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
我们使用该协议来可视化早期心脏祖细胞的NOTCH信号激活,这些信号在原始心脏管形态发生期间即将分化为内皮细胞。为此,我们将野生型C57BL / 6-N小鼠与Tg(CBF:H2BVenus,+)小鼠18 杂交,以获得通过黄色荧光蛋白Venus报告NOTCH活性的胚胎。在E7.5时,金星荧光存在于整个神经外胚层,在内脏和胚胎外中胚层有一些阳性细胞核。4小时后,内皮祖细胞激活金星并组装形成心内膜管和下面的主动脉,7小时后成为封闭结构(图4)。
图4:通过多光子成像实现活的全胚胎心脏发育。 从早期芽期CBF:H2BVenus+/- 小鼠胚胎的延时视频中选择的时间点(E7.5)。(A) 明场光学部分。(B)480-510nm检测器带显示金星荧光蛋白表达。比例尺 = 100 μm。黄色箭头指向发育中的心内膜腔和主动脉。时间以每个图像右上角的h:min表示。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
早期的心脏祖细胞组织在一个原始的心脏管中,该管在仍在形成时就开始跳动。了解这一过程是如何发生的,是将广泛的先天性心脏缺陷确定为特定形态发生事件的关键。为此,实时成像提供了一个机会来研究正常和有缺陷的胚胎发育,并提高时间分辨率。这对于研究早期心脏祖细胞特别有用,因为它们通过多种分化和迁移行为快速过渡7。
由于我们可以在单个标本中研究不同的胚胎阶段,因此此处介绍的实时成像协议可用于证实静态分析中研究的形态发生事件的插值。这将有助于以连续的方式理解发育事件的顺序。此外,实时分析产生多维数据,通过测量细胞行为,可以以前所未有的精度对细胞类型进行分类28。
尽管有其优点,但这里提出的方法有一些局限性。尽管胚胎可以在显微镜内发育长达48小时,但在长时间的采集中,感兴趣的区域往往会移出框架。为了防止这种情况发生,用户必须在采集过程中定期检查胚胎的漂移。尽管存在用于校正样品聚焦的自动系统12,但这些系统无法在大多数商用显微镜中实现。或者,两个或更多用户可以轮流监督和调整胚胎框架和堆叠,这样长时间的采集就不会那么具有挑战性。但是,必须记住,长期采购有相当大的失败机会,特别是对于未经培训的用户。解剖过程中轻微的胚胎损伤和支架中的定位不良是两个主要原因。为了提高这些技能,可以在尝试实时成像实验之前先在培养箱中培养已安装的胚胎。这样,人们可以在花费显微镜资源之前测试胚胎是否发育正常。
总之,实时成像方法为研究胚胎发育开辟了新的途径。这里介绍的方案允许详细分析突变胚胎中表型的起源或通过药理学操作测试特定分子途径的功能。通过这个视频工具包,我们的目标是促进其广泛使用,以了解早期心脏祖细胞的复杂性。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢Kenzo Ivanovitch博士以前在这种方法上的工作,以及Shigenori Nonaka博士(日本国立自然科学研究所)的小组提供了胚胎安装的初步专业知识。这项研究得到了西班牙科学和创新部的Grant PGC2018-096486-B-I00和欧盟地平线2020计划的Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427和FEDER Andalucía 2014-2020运营计划的MT和赠款1380918的支持。MS得到了La Caixa基金会博士奖学金(LCF / BQ / DE18 / 11670014)和生物学家公司旅行奖学金(DEVTF181145)的支持。CNIC得到了西班牙科学部和ProCNIC基金会的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
Distilled water | |||
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
P1000 and P200 pipettes | |||
Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Pipette tips | |||
Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
Tungsten needles | |||
Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
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