우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.
심장 발달의 첫 번째 단계는 세포 행동과 분화의 급격한 변화를 의미합니다. 고정된 배아를 분석하면 특정 발달 단계를 스틸 스냅샷에서 자세히 연구할 수 있지만, 라이브 이미징은 배아가 발달하는 과정을 이미징하여 세포 이동, 모양 변화 및 분화와 같은 동적 형태 발생 사건을 캡처합니다. 이것은 고정 분석을 보완하고 배아 발생 동안 장기가 어떻게 발달하는지에 대한 이해를 넓혀줍니다. 장점에도 불구하고 라이브 이미징은 기술적인 문제로 인해 마우스 모델에서 거의 사용되지 않습니다. 초기 마우스 배아는 생체 외에서 배양할 때 민감하며 효율적인 처리가 필요합니다. 마우스 발달 연구에서 라이브 이미징의 광범위한 사용을 촉진하기 위해 이 논문은 마우스 배아에서 장기간 획득할 수 있는 이광자 라이브 현미경에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜 외에도 배아 처리 및 배양 최적화에 대한 팁이 제공됩니다. 이것은 초기 마우스 기관 형성의 주요 사건을 이해하는 데 도움이 될 것이며, 심혈관 전구 생물학에 대한 이해를 높일 것입니다.
심장은 배아 발생 초기에 형성되어 전체 배아에 영양분을 펌핑하기 시작하면서 계속 발달합니다1. 마우스 배아에서, gastrulation이 시작된 지 1 일 반 후, 초보적인 심장 기관이 전극 2,3에 모입니다. 초기 줄무늬(ES) 단계에 이르면 상복부의 심장 전구체는 원시 줄무늬를 통해 초기 중배엽층 4,5,6으로 침투하고 전극으로 이동하기 시작하여 분화하여 원시 심장관을 형성합니다. 이 과정을 통해 초기 심장 전구체는 이동과 더불어 세포 재배열, 형태 변형, 분화를 겪는다7(그림 1).
초기 심장 전구체는 기능 기관을 동시에 구별하고 구축하는 놀라운 능력으로 인해 거의 한 세기 동안 연구자들을 매료 시켰습니다. 지난 20년 동안, 클론 분석 및 조건부 녹아웃 모델은 초기 심장 발달이 매우 역동적인 과정 8,9,10에서 뚜렷한 세포 공급원을 연루시킨다는 것을 보여주었다. 그러나 원시 심장관의 3D 구조와 형태 형성의 역동적인 특성으로 인해 연구하기가 어려우며(그림 1), 우리는 그것의 완전한 복잡성을 이해하는 것과는 거리가 멀다11.
이러한 동적 세포 과정을 연구하기 위해 라이브 이미징 방법은 이제 전례 없는 세부 정보를 제공합니다 7,12,13,14. 마우스 모델에서 실시간 접근 방식은 정적 분석 7,13,15로 다루기 어려운 발달 주제를 조사하는 데 핵심이었습니다. 장기간의 생체 외 배양과 강력한 현미경 설정이 빠르게 발전하고 있지만16,17, 살아있는 배아를 성공적으로 이미지화할 수 있는 전문 지식을 갖춘 연구자는 거의 없습니다. 종이 기반 출판물은 실시간 이미징 실험을 재현하기에 충분한 기술적 세부 정보를 제공하지만 일부 기술과 트릭은 시각적 예제나 피어 투 피어 지원 없이는 파악하기 어렵습니다. 이 학습 과정을 가속화하고 실험실 간에 실시간 이미징 사용을 확산하기 위해 우리는 가스를 배출하는 마우스 배아에 대한 라이브 이미징을 수행하는 데 필요한 기술을 수집하는 비디오 프로토콜(그림 2)을 조립했습니다.
그림 1: 마우스 배아에서 심장 전구 세포의 초기 분화는 위축의 시작부터 원시 심장관 형성 이전 단계까지 진행됩니다. 심장 전구 세포는 gastrulation이 시작된 직후 중배엽으로 침투하여 배아의 반대쪽으로 이동합니다. 형태학적 및 배아일(E) 단계가 다이어그램 위에 기록됩니다. 점선 화살표는 gastrulation 동안 원시 심장 튜브 전구 세포의 이동 궤적을 나타냅니다. 이 수치는11에서 채택되었습니다. 약어: ES = Early Streak; MS = 중간 줄무늬; EHF = 초기 머리 접기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초기 심장 전구체의 실시간 이미징을 위한 워크플로 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
초기 심장 전구 세포는 원시 심장 관을 조직하여 아직 형성되는 동안 박동하기 시작합니다. 이 과정이 어떻게 일어나는지 이해하는 것은 특정 형태 발생 사건에 대한 선천성 심장 결함의 광범위한 스펙트럼을 정확히 찾아내는 데 중요합니다. 이를 위해 라이브 이미징은 시간적 해상도가 증가하여 정상 및 결함 있는 배아 발달을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이것은 초기 심장 전구 세포가 ?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 이 방법에 대한 이전 연구에 대해 Kenzo Ivanovitch 박사와 배아 장착에 대한 초기 전문 지식을 제공한 Shigenori Nonaka 박사(일본 국립 자연 과학 연구소) 그룹에 감사를 표합니다. 이 연구는 스페인 Ministerio de Ciencia e Innovación의 Grant PGC2018-096486-B-I00 및 EU Horizon 2020 프로그램의 Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427에서 MT로, FEDER Andalucía 2014-2020 운영 프로그램에서 JND로의 Grant 1380918의 지원을 받았습니다. MS는 La Caixa Foundation PhD 펠로우십(LCF/BQ/DE18/11670014)과 The Company of Biologists 여행 펠로우십(DEVTF181145)의 지원을 받았습니다. CNIC는 스페인 과학부와 ProCNIC 재단의 지원을 받습니다.
#55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
Distilled water | |||
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
P1000 and P200 pipettes | |||
Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Pipette tips | |||
Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
Tungsten needles | |||
Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |