Live beeldvorming van vroege cardiale voorlopers in het muizenembryo
Summary
We presenteren een gedetailleerd protocol voor het kweken en beeldvorming van muizenembryo’s dat 3D + tijdbeeldvorming van cardiale voorlopercellen mogelijk maakt. Deze video-toolkit behandelt de belangrijkste vaardigheden die nodig zijn voor succesvolle live imaging die anders moeilijk te verkrijgen zijn uit tekstpublicaties.
Abstract
De eerste stappen van de ontwikkeling van het hart impliceren drastische veranderingen in celgedrag en differentiatie. Terwijl analyse van vaste embryo’s het mogelijk maakt om specifieke ontwikkelingsstadia in een stilstaande momentopname in detail te bestuderen, legt live beeldvorming dynamische morfogenetische gebeurtenissen vast, zoals celmigratie, vormveranderingen en differentiatie, door het embryo in beeld te brengen terwijl het zich ontwikkelt. Dit is een aanvulling op vaste analyse en vergroot het begrip van hoe organen zich ontwikkelen tijdens embryogenese. Ondanks de voordelen wordt live imaging zelden gebruikt in muismodellen vanwege de technische uitdagingen. Vroege muizenembryo’s zijn gevoelig wanneer ze ex vivo worden gekweekt en vereisen een efficiënte behandeling. Om een breder gebruik van live imaging in onderzoek naar de ontwikkeling van muizen mogelijk te maken, presenteert dit artikel een gedetailleerd protocol voor twee-foton live microscopie dat langdurige acquisitie in muizenembryo’s mogelijk maakt. Naast het protocol worden er tips gegeven over embryobehandeling en kweekoptimalisatie. Dit zal helpen bij het begrijpen van belangrijke gebeurtenissen in de vroege organogenese van muizen, waardoor het begrip van de cardiovasculaire voorloperbiologie wordt verbeterd.
Introduction
Het hart vormt zich vroeg tijdens de embryogenese om voedingsstoffen naar het hele embryo te pompen, terwijl het zich blijft ontwikkelen1. Bij muizenembryo’s verzamelt anderhalve dag na het begin van de gastrulatie een rudimentair hartorgaan zich aan de voorste pool 2,3. In het stadium van de vroege streep (ES) dringen hartvoorlopers in de epiblast binnen via de primitieve streep naar de ontluikende mesodermale laag 4,5,6 en beginnen te migreren naar de voorste pool, waar ze differentiëren om de primitieve hartbuis te vormen. Gedurende dit proces ondergaan vroege hartvoorlopers celherschikkingen, vormtransformaties en differentiatie, naast migratie7 (figuur 1).
Vroege cardiale voorlopers hebben bijna een eeuw lang onderzoekers aangetrokken vanwege hun opmerkelijke vermogen om tegelijkertijd te differentiëren en een functioneel orgaan te bouwen. In de afgelopen twee decennia hebben klonale analyse en voorwaardelijke knock-outmodellen aangetoond dat vroege hartontwikkeling verschillende celbronnen impliceert in een zeer dynamisch proces 8,9,10. De 3D-structuur van de primitieve hartbuis en de dynamische aard van zijn morfogenese maken het echter een uitdaging om te bestuderen (figuur 1), en we zijn nog lang niet klaar met het begrijpen van de volledige complexiteitervan 11.
Om deze dynamische cellulaire processen te bestuderen, bieden live beeldvormingsmethoden nu een ongekend detail 7,12,13,14. In het muismodel zijn live benaderingen de sleutel geweest tot het ondervragen van ontwikkelingsonderwerpen die moeilijk aan te pakken zijn door statische analyse 7,13,15. Terwijl langdurige ex vivo kweek en robuuste microscoopopstellingen snel vorderen16,17, hebben maar weinig onderzoekers de expertise om levende embryo’s met succes in beeld te brengen. Hoewel papieren publicaties voldoende technische details bieden om live beeldvormingsexperimenten te reproduceren, zijn sommige vaardigheden en trucs moeilijk te begrijpen zonder visuele voorbeelden of peer-to-peer-assistentie. Om dit leerproces te versnellen en het gebruik van live imaging onder laboratoria te verspreiden, hebben we een videoprotocol samengesteld (figuur 2) dat de nodige vaardigheden verzamelt om live imaging uit te voeren op gastrulerende muizenembryo’s.
Figuur 1: Vroege differentiatie van cardiale voorlopercellen in het muizenembryo vanaf het begin van gastrulatie tot het stadium voorafgaand aan primitieve hartbuisvorming. Cardiale voorlopercellen dringen het mesoderm binnen kort na het begin van de gastrulatie en migreren naar de andere kant van het embryo. Morfologische en embryonale dag (E) fase zijn geschreven op de top van de diagrammen. Onderbroken pijlen verbeelden het migratietraject van primitieve hartbuisvoorlopers tijdens gastrulatie. Dit cijfer werd aangepast van11. Afkortingen: ES = Early Streak; MS = middelste streep; EHF = vroege hoofdplooi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Werkstroomdiagram voor live beeldvorming van vroege hartvoorlopers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vroege hartvoorlopers organiseren zich in een primitieve hartbuis die begint te kloppen terwijl deze zich nog aan het vormen is. Begrijpen hoe dit proces plaatsvindt, is de sleutel tot het lokaliseren van het brede spectrum van aangeboren hartafwijkingen tot specifieke morfogenetische gebeurtenissen. Daarvoor biedt live beeldvorming de mogelijkheid om de normale en gebrekkige embryonale ontwikkeling met verhoogde temporele resolutie te bestuderen. Dit is vooral nuttig om vroege cardiale voorlopercellen te bestuderen, omd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Dr. Kenzo Ivanovitch voor eerder werk aan deze methode en de groep van Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) voor het leveren van de initiële expertise over embryomontage. Deze studie werd ondersteund door Grant PGC2018-096486-B-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 van het EU Horizon 2020-programma aan MT en Grant 1380918 van het FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program aan JND. MS werd ondersteund door een La Caixa Foundation PhD fellowship (LCF/BQ/DE18/11670014) en The Company of Biologists travelling fellowship (DEVTF181145). De CNIC wordt ondersteund door het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de ProCNIC Foundation.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021)
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).
