Levende avbildning av tidlige hjerteprogenitorer i museembryoet

Summary

Vi presenterer en detaljert protokoll for museembryokultur og avbildning som muliggjør 3D + tidsavbildning av hjerteprogenitorceller. Dette videoverktøysettet tar for seg de viktigste ferdighetene som kreves for vellykket live bildebehandling, ellers vanskelig å skaffe seg fra tekstpublikasjoner.

Abstract

De første trinnene i hjerteutvikling innebærer drastiske endringer i celleadferd og differensiering. Mens analyse av faste embryoer gjør det mulig å studere i detalj spesifikke utviklingsstadier i et stillbilde, fanger levende bildebehandling dynamiske morfogenetiske hendelser, for eksempel cellemigrasjon, formendringer og differensiering, ved å avbilde embryoet når det utvikler seg. Dette utfyller fast analyse og utvider forståelsen av hvordan organer utvikler seg under embryogenese. Til tross for fordelene brukes levende bildebehandling sjelden i musemodeller på grunn av tekniske utfordringer. Tidlige museembryoer er følsomme når de dyrkes ex vivo og krever effektiv håndtering. For å legge til rette for en bredere bruk av levende bildebehandling i museutviklingsforskning, presenterer dette papiret en detaljert protokoll for to-foton levende mikroskopi som muliggjør langsiktig oppkjøp i museembryoer. I tillegg til protokollen gis tips om embryohåndtering og kulturoptimalisering. Dette vil bidra til å forstå viktige hendelser i tidlig museorganogenese, og øke forståelsen av kardiovaskulær stamcellebiologi.

Introduction

Hjertet dannes tidlig under embryogenesen for å begynne å pumpe næringsstoffer til hele embryoet, mens det fortsetter å utvikle^{seg 1}. I museembryoer, en og en halv dag etter initiering av gastrulasjon, samles et rudimentært hjerteorgan ved den fremre polen ^2,3. Ved tidlig strekstadium (ES) kommer hjerteprogenitorer i epiblastingressen gjennom den primitive streken til det gryende mesodermale laget ^4,5,6 og begynner å migrere til den fremre polen^, hvor de differensierer for å danne det primitive hjerterøret. Gjennom denne prosessen gjennomgår tidlige hjerteprogenitorer celleomorganiseringer, formtransformasjoner og differensiering, i tillegg til migrasjon⁷ (figur 1).

Tidlige hjerteprogenitorer har tiltrukket forskere i nesten et århundre på grunn av deres bemerkelsesverdige evne til å differensiere og bygge et funksjonelt organ samtidig. I løpet av de siste to tiårene har klonal analyse og betingede knockout-modeller vist at tidlig hjerteutvikling impliserer forskjellige cellekilder i en svært dynamisk prosess ^8,9,10. 3D-strukturen til det primitive hjerterøret og den dynamiske naturen til dets morfogenese gjør det imidlertid utfordrende å studere (figur 1), og vi er langt fra å forstå dets fulle kompleksitet¹¹.

For å studere disse dynamiske cellulære prosessene, tilbyr levende bildebehandlingsmetoder nå en enestående detalj 7,12,13,14. I musemodellen har levende tilnærminger vært nøkkelen til å undersøke utviklingstemaer som er vanskelige å ta opp ved statisk analyse 7,13,15. Mens langsiktig ex vivo-kultur og robuste mikroskopoppsett utvikler seg raskt^16,17, har få forskere ekspertisen til å lykkes med å avbilde levende embryoer. Selv om papirbaserte publikasjoner gir nok tekniske detaljer til å reprodusere live bildebehandlingseksperimenter, er noen ferdigheter og triks vanskelig å forstå uten visuelle eksempler eller peer-to-peer assistanse. For å akselerere denne læringsprosessen og spre bruken av levende bildebehandling blant laboratorier, samlet vi en videoprotokoll (figur 2) som samler de nødvendige ferdighetene til å utføre levende bildebehandling på gastrulating museembryoer.

Figur 1 Tidlig differensiering av hjerteprogenitorceller i museembryoet fra debut av gastrulering til stadium forut for primitiv hjerterørsdannelse. Hjerteprogenitorceller kommer inn i mesodermen kort tid etter starten av gastruleringen, og migrerer til motsatt side av embryoet. Morfologisk og embryonal dag (E) stadium er skrevet på toppen av diagrammene. Stiplede piler skildrer migrasjonsbanen til primitive hjerterørprogenitorer under gastrulasjon. Dette tallet ble tilpasset fra¹¹. Forkortelser: ES = tidlig strek; MS = Midt strek; EHF = tidlig hodefold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Arbeidsflytdiagram for levende avbildning av tidlige hjerteprogenitorer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av CNIC Animal Experimentation Ethics Committee, av Madrid-regionen (referanse PROEX 220/15) og i samsvar med EU-direktiv 2010/63EU og anbefaling 2007/526 / EC om beskyttelse av dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål, håndhevet i spansk lov under Real Decreto 1201/2005. Denne protokollen inkluderer bruk av to hanner fra den fluorescerende transgene muselinjen som rapporterer NOTCH-aktivitet Tg(CBF:H2BVenus,+)18</su…

Representative Results

Vi brukte protokollen til å visualisere NOTCH-signalaktivering hos tidlige hjerteprogenitorer som var i ferd med å differensiere til endotelceller under primitiv hjerterørmorfogenese. For det krysset vi villtype C57BL/6-N-mus med Tg (CBF: H2BVenus, +) mus18 for å oppnå embryoer som rapporterte NOTCH-aktivitet gjennom gult fluorescerende protein Venus. Ved E7.5 er Venus-fluorescens tilstede gjennom hele nevralektodermen, med noen få positive kjerner ved splanknisk og ekstraembryonisk mesoderm…

Discussion

Tidlige hjerteprogenitorer organiserer seg i et primitivt hjerterør som begynner å slå mens det fortsatt dannes. Å forstå hvordan denne prosessen foregår er nøkkelen til å finne det brede spekteret av medfødte hjertefeil til spesifikke morfogenetiske hendelser. For det gir levende bildebehandling en mulighet til å studere normal og defekt embryonal utvikling med økt tidsmessig oppløsning. Dette er spesielt nyttig for å studere tidlige hjerteprogenitorceller da de overgår raskt gjennom flere differensierings…

Materials

#55 Forceps	Dumont	11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter	Mattek	P35G-1.5-14-C
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
50 mL tubes	BD Falcon	352070
Distilled water
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)	JAX
Fluorobrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease	Dow Corning	Z273554-1EA
Holder for wires	Perlen Pressen	pwb1
LSM 780 Upright microscope	Zeiss
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm	Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)	Zeiss
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance	Zeiss
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil	Nidacon	VNI0049
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063	(the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm	BD Falcon	351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Set of 160 mm fines	RS PRO	541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries	Anima Lab	1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter	Corning	431218
Sterile 5 mL syringe	Fisher Scientific	15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator)	Bandelin	BASO_17021