Summary

פרוטוקול השתלת לב הטרוטופי מורין מותאם לסטנדרטים עכשוויים של טכניקה אספטית, הרדמה ושיכוך כאבים

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

המאמר הנוכחי מתאר טכניקה שונה להשתלת לב הטרוטופית וסקולרית עם טכניקה אספטית מעודכנת, שיכוך כאבים והרדמה.

Abstract

פיתוח מודלים ניסיוניים של השתלות לב בבעלי חיים תרם להתקדמות רבה בתחומי האימונולוגיה והשתלות איברים מוצקים. בעוד שמודל השתלת הלב ההטרוטופית של כלי הדם ההמוניים שימש בתחילה במחקרים על דחיית שתלים באמצעות שילובים של זני עכברים מולדים שאינם תואמים, גישה לזנים מהונדסים גנטית ולשיטות טיפוליות יכולה לספק תובנות פרה-קליניות חדשות ועוצמתיות. ביסודו של דבר, המתודולוגיה הכירורגית של טכניקה זו לא השתנתה מאז התפתחותה, במיוחד ביחס לגורמים חשובים כגון טכניקה אספטית, הרדמה ושיכוך כאבים, אשר משפיעים באופן מהותי על תחלואה ותמותה לאחר ניתוח. בנוסף, שיפורים בניהול הפריאופרטיבי צפויים לספק שיפורים הן ברווחת בעלי החיים והן בתוצאות הניסויים. מאמר זה מדווח על פרוטוקול שפותח בשיתוף פעולה עם מומחה בתחום ההרדמה הווטרינרית ומתאר את הטכניקה הכירורגית בדגש על ניהול פריאופרטיבי. בנוסף, אנו דנים בהשלכות של חידודים אלה ומספקים פרטים על פתרון בעיות בשלבים כירורגיים קריטיים עבור הליך זה.

Introduction

אנו חייבים חלק גדול מהבנתנו באימונולוגיה ובהשתלות למחקר המבוסס על מודלים ניסיוניים של השתלת איברים מוצקים בבעלי חיים. מאז התיאור הראשון של השתלת לב וסקולרית ביונקים1, מודלים כאלה תרמו לידע בתחומים רחבים, כולל היישום הטיפולי של היפותרמיה2, היתרונות של שימוש בתפרים מיוחדים3, וטכניקותלהשתלות ריאה ולב 4. פיתוח מודלים להשתלות לב בחולדות 5,6 סיפק טווח רחב יותר לניסויים אימונולוגיים בשל זמינותם של קווי רבייה שונים. הטווח הרחב משמעותית של זני עכברים מוטנטיים ומוטנטיים זמינים הוביל את Corry et al.7 לפתח טכניקה של השתלת לב הטרוטופית מורין בשל היתרונות הניכרים שטווח זה מביא למחקר ההשתלות. מודל זה נמצא בשימוש נרחב ותרם להבנה טובה יותר של דחיית השתל8 וטיפולים9. עם זאת, מאז תיאורה הראשון, הטכניקה נותרה כמעט ללא שינוי מלבד כמה פרטים טכניים קטנים כגון התאמות למיקום של אתרים אנסטומטיים10,11.

מאז שילוב הטכניקה של Corry et al.7 בניסויים שלנו, זיהינו תחומים מבטיחים לשיפור הפרוטוקול, כלומר אלה של טכניקה אספטית, הרדמה ושיכוך כאבים. שיפורים בתחומים אלה היו צפויים להציע השפעה חיובית על תוצאות הניסויים ולשפר את רווחת בעלי החיים. זה הוכח בעבר כאשר טכניקה אספטית משמשת בניתוחים בבעלי חיים קטנים כפי שהוא מסייע בהפחתת זיהומים לאחר הניתוח12, אשר לא רק משפיע על תחלואה ותמותה, אבל יכול גם לפגוע ניסויים שנועדו להעריך את התגובה החיסונית לאחר ניתוח השתלה. מנקודת מבט של הרדמה ומשכך כאבים, השימוש במשטר מעודן מסייע להפחית את העלות לבעלי חיים ולאזן את הטיעון האתי של מודל כירורגי זה על ידי הפחתת הכאב והסבל של נבדקים ניסיוניים. יתר על כן, הרדמה מתאימה ושיכוך כאבים מגבילים את תגובת הלחץ הקשורה לכאב, משפרים את איכות ההתאוששות לאחר הניתוח, ובסופו של דבר, מגדילים את שיעור ההצלחה הניתוחית13.

במטרה לשפר הן את רווחת בעלי החיים והן את תוצאות הניסויים, פותח פרוטוקול עם התאמות כדי לגשר על פערים אלה. פרוטוקול זה הותאם מזה שתואר במקור על ידי Corry et al.7 תוך התייעצות עם רופא מרדים וטרינרי ותוך התחשבות נאותה הן בהשפעות והן במשך ההשפעות של ההתערבויות הפרמקולוגיות המשמשות במשטר ההרדמה ומשככי הכאבים. הגישה התבססה על עקרונות של הרדמה מאוזנת ושיכוך כאבים מולטימודאלי כדי להבטיח טיפול פריאופרטיבי מתאים14. בנוסף ליישום של טכניקה אספטית, אופיואיד buprenorphine ואת bupivacaine הרדמה מקומית ניתנו מראש. הרדמה כללית בוצעה באמצעות חומר הרדמה ממסים נדיפים isoflurane.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם לקוד העיסוק לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות15 ואושר תחת פרוטוקולים אתיקה של בעלי חיים RA/3/100/1568 ו-AE173 (ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת מערב אוסטרליה וועדת האתיקה של בעלי חיים במכון הארי פרקינס למחקר רפואי, בהתאמה). עיין בטבלת החומרים לקבלת …

Representative Results

כדי לקבוע את יעילות הטכניקה הכירורגית בקידום תוצאות טובות של ריפוי פצעים והתאוששות עכבר, ניסויים מוקדמים במעבדה קבעו את מאפייני ההישרדות של מגוון שתלי לב בעלי אימונוגניות משתנה לנמען. אלה כללו שתלים קונגניים (n = 5) וסינגנים (n = 5), החולקים את אותם סמנים מורכבים היסטו-תאימות עיקריים (MHC) כמו הנ…

Discussion

מודל השתלת הלב האורתוטופית של מורין הוא מודל פרה-קליני חזק המשמש בעיקר לחקר ההשפעות של חוסר התאמה MHC על רמת ואופי הדחייה החיסונית, ולאחרונה, השפעת ההשתלה על שימור חסינות תושב רקמת השתל16. בתחילה עקבנו מקרוב אחר פרוטוקול Corry et al.7 , אך שיפרנו את הפרוטוקול כך שישלב סטנד…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות על המאמצים המעולים של צוות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מערב אוסטרליה ושל מכון הארי פרקינס למחקר רפואי, שמסירותם ומומחיותם תרמו להיתכנות ולהצלחה של ניתוחים אלה.

Materials

2030 Rycroft irrigating cannula 30 G McFarlane 56005HU
Braided surgical silk 7-0
Bulldog clamp curved – 35 mm  Roboz RS-7441-5
Bupivacaine 0.25% 
Buprenorphine
Castroviejo needle holder catch curved -  145 mm Haag-Streit 11.62.15
Chlorhexidine 5% solution Ebos JJ61371
Cotton-tipped applicator – 7.5 cm Dove SN109510
Ethanol 70% solution Ebos WH130192EE
Gauze 5 x 5 cm white Aero AGS50
Gelfoam 80 mm x 125 mm  Pfizer 7481D
Hair clipper Wahl 9860L
Heparin 1,000 IU in 1 mL
Iris SuperCut scissors straight – 11.5 cm   Inka Surgical  11550.11
Isoflurane vaporiser Darvall 9176
Micro bulldog clamp – 3.7 cm Greman 14119-G
Micro scissors curved 105 mm 
Micropore plain paper surgical tape – 2.5 cm wide Ebos 7810L
Microsurgical scissors – curved tip
Monofilament polyprolene suture – 5/0 Surgipro P-205-X
Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g Myweigh Kit00053
Needle – 30 G x 0.5 inch BD BD304000
Needleholder 15 cm curved "super fine" Surgical Specialists ST-B-15-8.2
Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300
Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm B. Braun FD281R
Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm B. Braun FD280R
Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm 15400-12
Spring scissors-Cvd Sm blades 15001-08
Stevens scissors blunt straight 110 mm
Surgical backboard Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm
Surgical drapes Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm 
Surgical microscope
Syringe – 1 mL BD 592696
Syringe – 3 mL Leica M651
Toothed forceps BD 309657
University of Wisconsin Solution
Warming pad Far infrared warming pad 20 x 25 cm
Westcott spring scissors
Yasargil clip applier bayonet Aesculap FE582K
Yasargil titanium clip perm 6.6 mm Aesculap A19FT222T
Mouse usage
Strain/SEX/Weight Donor Recipent
BALB/c, female, 19-23 g 7 21
C57BL/6, female, 17-20 g 7 0
CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g 5 0

References

  1. Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M. Transplantation of the intact mammalian heart. Archives of Surgery. 26 (2), 219-224 (1933).
  2. Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F. Complete homologous heart transplantation. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (2), 174-178 (1953).
  3. Downie, H. G. Homotransplantation of the dog heart. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (5), 624-636 (1953).
  4. Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
  5. Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
  6. Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
  7. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  8. Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
  9. Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
  10. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  11. Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
  12. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Current Protocols in Immunology. 82, 1-14 (2008).
  13. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
  14. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  15. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  16. Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).

Play Video

Cite This Article
Singer, D. A., Musk, G. C., Huang, W. H., Liu, L., Kaur, J., Watson, M., Prosser, A., Lucas, M., Lucas, A. A Modified Murine Heterotopic Heart Transplant Protocol Matching Contemporary Standards of Aseptic Technique, Anesthesia, and Analgesia. J. Vis. Exp. (187), e64284, doi:10.3791/64284 (2022).

View Video