Protocolo de transplante cardíaco heterotópico murino modificado que atende aos padrões contemporâneos de técnica asséptica, anestesia e analgesia
Summary
O presente artigo descreve uma técnica modificada para transplante cardíaco vascularizado heterotópico com técnica asséptica atualizada, analgesia e anestesia.
Abstract
O desenvolvimento de modelos experimentais de transplante cardíaco em animais tem contribuído para muitos avanços nos campos da imunologia e do transplante de órgãos sólidos. Embora o modelo de transplante cardíaco murino vascularizado heterotópico tenha sido inicialmente utilizado em estudos de rejeição de enxertos usando combinações de linhagens de camundongos incompatíveis, o acesso a cepas geneticamente modificadas e modalidades terapêuticas pode fornecer novos e poderosos insights pré-clínicos. Fundamentalmente, a metodologia cirúrgica dessa técnica não mudou desde o seu desenvolvimento, especialmente no que diz respeito a fatores importantes como técnica asséptica, anestesia e analgesia, que causam impactos materiais na morbimortalidade pós-cirúrgica. Além disso, espera-se que melhorias no manejo perioperatório proporcionem melhorias tanto no bem-estar animal quanto nos resultados experimentais. Este artigo relata um protocolo desenvolvido em colaboração com um especialista no assunto em anestesia veterinária e descreve a técnica cirúrgica com ênfase no manejo perioperatório. Além disso, discutimos as implicações desses refinamentos e fornecemos detalhes sobre a solução de problemas de etapas cirúrgicas críticas para esse procedimento.
Introduction
Devemos muito de nossa compreensão de imunologia e transplante à pesquisa baseada em modelos experimentais de transplante de órgãos sólidos usando cobaias animais. Desde a primeira descrição do transplante cardíaco vascularizado emmamíferos1, tais modelos têm contribuído para o conhecimento em amplos domínios, incluindo a aplicação terapêutica da hipotermia2, os benefícios do uso de suturas especializadas3 e técnicas para homotransplantes totais de pulmão e coração4. O desenvolvimento de modelos de transplante cardíaco emratos5,6 proporcionou maior escopo para experimentação imunológica devido à disponibilidade de diferentes linhagens. A gama substancialmente maior de linhagens de camundongos endogâmicas e mutantes disponíveis levou Corry et al.7 a desenvolver uma técnica de transplante cardíaco heterotópico murino devido às consideráveis vantagens que essa faixa traz para a pesquisa em transplantes. Esse modelo tem sido amplamente utilizado e tem contribuído para um maior entendimento da rejeição do enxerto8 e da terapêutica9. Desde sua primeira descrição, entretanto, a técnica permaneceu praticamente inalterada, além de alguns pequenos detalhes técnicos, como ajustes na posição dos sítios anastomóticos10,11.
Desde a integração da técnica de Corry et al.7 em nossos experimentos, identificamos áreas promissoras para o aprimoramento do protocolo, a saber, técnicas assépticas, anestesia e analgesia. Esperava-se que as melhorias nessas áreas oferecessem um impacto positivo nos resultados experimentais e melhorassem o bem-estar animal. Isso já foi demonstrado quando a técnica asséptica é utilizada em cirurgias de pequenos animais, pois auxilia na redução de infecções pós-operatórias12, o que não só impacta na morbidade e mortalidade, mas também pode comprometer experimentos desenhados para avaliar a resposta imune após a cirurgia de transplante. Do ponto de vista anestésico e analgésico, o uso de um regime refinado ajuda a reduzir o custo para os animais e equilibrar o argumento ético desse modelo cirúrgico, atenuando a dor e o sofrimento dos sujeitos experimentais. Além disso, a anestesia e a analgesia adequadas limitam a resposta ao estresse associada à dor, melhorando a qualidade da recuperação pós-operatória e, finalmente, aumentando a taxa de sucesso cirúrgico13.
Com o objetivo de melhorar o bem-estar animal e os resultados experimentais, um protocolo foi desenvolvido com ajustes para preencher essas lacunas. Este protocolo foi adaptado daquele originalmente descrito por Corry et al.7 com consulta de um anestesista veterinário e com a devida consideração tanto dos efeitos quanto da duração dos efeitos das intervenções farmacológicas utilizadas no regime anestésico e analgésico. A abordagem baseou-se nos princípios da anestesia balanceada e da analgesia multimodal para garantir cuidados perioperatórios adequados14. Além da aplicação da técnica asséptica, o opioide buprenorfina e o anestésico local bupivacaína foram administrados preventivamente. A anestesia geral foi realizada com o anestésico inalatório isoflurano.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de transplante cardíaco ortotópico murino é um modelo pré-clínico robusto usado principalmente para investigar os efeitos da incompatibilidade MHC sobre o nível e a natureza da rejeição imunológica e, mais recentemente, o efeito do transplante na retenção da imunidade residente no tecido do enxerto16. Embora inicialmente seguindo de perto o protocolo de Corry et al.7 , refinamos o protocolo para incorporar padrões de melhores práticas de técnica assé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer os esforços soberbos da equipe de cuidados com animais da Universidade da Austrália Ocidental e do Harry Perkins Institute of Medical Research, cuja dedicação e experiência contribuíram para a viabilidade e o sucesso dessas cirurgias.
Materials
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved – 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator – 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight – 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp – 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape – 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors – curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture – 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle – 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe – 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe – 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | 0 | |
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 | 0 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M. Transplantation of the intact mammalian heart. Archives of Surgery. 26 (2), 219-224 (1933).
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F. Complete homologous heart transplantation. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (2), 174-178 (1953).
- Downie, H. G. Homotransplantation of the dog heart. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (5), 624-636 (1953).
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Current Protocols in Immunology. 82, 1-14 (2008).
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
