Summary

Un protocollo di trapianto di cuore eterotopico murino modificato che corrisponde agli standard contemporanei di tecnica asettica, anestesia e analgesia

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Il presente articolo descrive una tecnica modificata per il trapianto cardiaco vascolarizzato eterotopico con tecnica asettica, analgesia e anestesia aggiornate.

Abstract

Lo sviluppo di modelli sperimentali di trapianto cardiaco negli animali ha contribuito a molti progressi nel campo dell’immunologia e del trapianto di organi solidi. Mentre il modello di trapianto cardiaco murino vascolarizzato eterotopico è stato inizialmente utilizzato negli studi sul rigetto del trapianto utilizzando combinazioni di ceppi di topo inbred non corrispondenti, l’accesso a ceppi geneticamente modificati e modalità terapeutiche può fornire nuove potenti intuizioni precliniche. Fondamentalmente, la metodologia chirurgica per questa tecnica non è cambiata dal suo sviluppo, soprattutto per quanto riguarda fattori importanti come la tecnica asettica, l’anestesia e l’analgesia, che hanno un impatto materiale sulla morbilità e mortalità post-chirurgica. Inoltre, ci si aspetta che i miglioramenti nella gestione perioperatoria forniscano miglioramenti sia nel benessere degli animali che nei risultati sperimentali. Questo articolo riporta un protocollo sviluppato in collaborazione con un esperto in anestesia veterinaria e descrive la tecnica chirurgica con particolare attenzione alla gestione perioperatoria. Inoltre, discutiamo le implicazioni di questi perfezionamenti e forniamo dettagli sulla risoluzione dei problemi dei passaggi chirurgici critici per questa procedura.

Introduction

Dobbiamo gran parte della nostra comprensione dell’immunologia e dei trapianti alla ricerca basata su modelli sperimentali di trapianto di organi solidi utilizzando soggetti animali. Fin dalla prima descrizione del trapianto cardiaco vascolarizzato nei mammiferi1, tali modelli hanno contribuito alla conoscenza in ampi settori, tra cui l’applicazione terapeutica dell’ipotermia2, i benefici dell’uso di suture specializzate3 e le tecniche per l’omotrapianto totale di polmoni e cuore4. Lo sviluppo di modelli di trapianto cardiaco nei ratti 5,6 ha fornito un più ampio spazio per la sperimentazione immunologica a causa della disponibilità di diverse linee di allevamento. La gamma sostanzialmente più ampia di ceppi di topo inbred e mutanti disponibili ha portato Corry et al.7 a sviluppare una tecnica di trapianto cardiaco eterotopico murino a causa dei notevoli vantaggi che questa gamma porta alla ricerca sui trapianti. Questo modello è stato ampiamente utilizzato e ha contribuito a una maggiore comprensione del rigetto del trapianto8 e delle terapie9. Dalla sua prima descrizione, tuttavia, la tecnica è rimasta sostanzialmente invariata a parte alcuni dettagli tecnici minori come le regolazioni alla posizione dei siti anastomotici10,11.

Dall’integrazione della tecnica di Corry et al.7 nei nostri esperimenti, abbiamo identificato aree promettenti per migliorare il protocollo, vale a dire quelle della tecnica asettica, dell’anestesia e dell’analgesia. Ci si aspettava che i miglioramenti in queste aree offrissero un impatto positivo sui risultati sperimentali e migliorassero il benessere degli animali. Ciò è stato precedentemente dimostrato quando la tecnica asettica viene utilizzata negli interventi chirurgici di piccoli animali in quanto aiuta a ridurre le infezioni postoperatorie12, che non solo influisce sulla morbilità e sulla mortalità, ma può anche compromettere gli esperimenti progettati per valutare la risposta immunitaria dopo l’intervento chirurgico di trapianto. Dal punto di vista anestesialogico e analgesico, l’uso di un regime raffinato aiuta a ridurre il costo per gli animali e bilanciare l’argomento etico di questo modello chirurgico mitigando il dolore e la sofferenza dei soggetti sperimentali. Inoltre, l’anestesia e l’analgesia appropriate limitano la risposta allo stress associata al dolore, migliorando la qualità del recupero postoperatorio e, in definitiva, aumentando il tasso di successo chirurgico13.

Con l’obiettivo di migliorare sia il benessere degli animali che i risultati sperimentali, è stato sviluppato un protocollo con adeguamenti per colmare queste lacune. Questo protocollo è stato adattato da quello originariamente descritto da Corry et al.7 con la consultazione di un anestesista veterinario e con la dovuta considerazione sia per gli effetti che per la durata degli effetti degli interventi farmacologici utilizzati nel regime anestetico e analgesico. L’approccio si è basato sui principi dell’anestesia bilanciata e dell’analgesia multimodale per garantire un’adeguata assistenza perioperatoria14. Oltre all’applicazione della tecnica asettica, sono stati somministrati preventivamente l’oppioide buprenorfina e l’anestetico locale bupivacaina. L’anestesia generale è stata eseguita utilizzando l’agente anestetico inalante isoflurano.

Protocol

Questa ricerca è stata eseguita in conformità con il Codice di condotta per la cura e l’uso di animali per scopi scientifici15 e approvato ai sensi dei protocolli di etica animale RA/3/100/1568 e AE173 (The University of Western Australia Animal Ethics Committee e The Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee, rispettivamente). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e gli animali utilizzati in questo p…

Representative Results

Per determinare l’efficacia della tecnica chirurgica nel promuovere buoni risultati di guarigione delle ferite e recupero del topo, i primi esperimenti in laboratorio hanno determinato le caratteristiche di sopravvivenza di una serie di innesti cardiaci di immunogenicità variabile al ricevente. Questi includevano innesti congenici (n = 5) e singeneici (n = 5), che condividono gli stessi marcatori del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) del ricevente, e innesti di mismatch maggiore (n = 9), in cui l’innesto e …

Discussion

Il modello di trapianto di cuore ortotopico murino è un robusto modello preclinico utilizzato principalmente per studiare gli effetti del mismatch MHC sul livello e la natura del rigetto immunologico e, più recentemente, l’effetto del trapianto sulla conservazione dell’immunità residente nel tessuto del trapianto16. Pur seguendo inizialmente da vicino il protocollo Corry et al.7 , abbiamo perfezionato il protocollo per incorporare gli standard delle migliori pratiche di …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano riconoscere i superbi sforzi del personale addetto alla cura degli animali dell’Università dell’Australia occidentale e dell’Harry Perkins Institute of Medical Research, la cui dedizione e competenza hanno contribuito alla fattibilità e al successo di questi interventi chirurgici.

Materials

2030 Rycroft irrigating cannula 30 G McFarlane 56005HU
Braided surgical silk 7-0
Bulldog clamp curved – 35 mm  Roboz RS-7441-5
Bupivacaine 0.25% 
Buprenorphine
Castroviejo needle holder catch curved -  145 mm Haag-Streit 11.62.15
Chlorhexidine 5% solution Ebos JJ61371
Cotton-tipped applicator – 7.5 cm Dove SN109510
Ethanol 70% solution Ebos WH130192EE
Gauze 5 x 5 cm white Aero AGS50
Gelfoam 80 mm x 125 mm  Pfizer 7481D
Hair clipper Wahl 9860L
Heparin 1,000 IU in 1 mL
Iris SuperCut scissors straight – 11.5 cm   Inka Surgical  11550.11
Isoflurane vaporiser Darvall 9176
Micro bulldog clamp – 3.7 cm Greman 14119-G
Micro scissors curved 105 mm 
Micropore plain paper surgical tape – 2.5 cm wide Ebos 7810L
Microsurgical scissors – curved tip
Monofilament polyprolene suture – 5/0 Surgipro P-205-X
Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g Myweigh Kit00053
Needle – 30 G x 0.5 inch BD BD304000
Needleholder 15 cm curved "super fine" Surgical Specialists ST-B-15-8.2
Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300
Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm B. Braun FD281R
Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm B. Braun FD280R
Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm 15400-12
Spring scissors-Cvd Sm blades 15001-08
Stevens scissors blunt straight 110 mm
Surgical backboard Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm
Surgical drapes Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm 
Surgical microscope
Syringe – 1 mL BD 592696
Syringe – 3 mL Leica M651
Toothed forceps BD 309657
University of Wisconsin Solution
Warming pad Far infrared warming pad 20 x 25 cm
Westcott spring scissors
Yasargil clip applier bayonet Aesculap FE582K
Yasargil titanium clip perm 6.6 mm Aesculap A19FT222T
Mouse usage
Strain/SEX/Weight Donor Recipent
BALB/c, female, 19-23 g 7 21
C57BL/6, female, 17-20 g 7 0
CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g 5 0

References

  1. Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M. Transplantation of the intact mammalian heart. Archives of Surgery. 26 (2), 219-224 (1933).
  2. Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F. Complete homologous heart transplantation. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (2), 174-178 (1953).
  3. Downie, H. G. Homotransplantation of the dog heart. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (5), 624-636 (1953).
  4. Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
  5. Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
  6. Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
  7. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  8. Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
  9. Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
  10. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  11. Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
  12. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Current Protocols in Immunology. 82, 1-14 (2008).
  13. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
  14. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  15. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  16. Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).

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Cite This Article
Singer, D. A., Musk, G. C., Huang, W. H., Liu, L., Kaur, J., Watson, M., Prosser, A., Lucas, M., Lucas, A. A Modified Murine Heterotopic Heart Transplant Protocol Matching Contemporary Standards of Aseptic Technique, Anesthesia, and Analgesia. J. Vis. Exp. (187), e64284, doi:10.3791/64284 (2022).

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