Summary

Konstruktion af cykliske peptider ved hjælp af et on-tether sulfoniumcenter

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Denne protokol præsenterer syntesen af cykliske peptider via bisalkylering mellem cystein og methionin og den letkøbte thiol-yne-reaktion udløst af propargylsulfoniumcentret.

Abstract

I de senere år har cykliske peptider tiltrukket stigende opmærksomhed inden for lægemiddelopdagelse på grund af deres fremragende biologiske aktiviteter, og som følge heraf anvendes de nu klinisk. Det er derfor afgørende at søge effektive strategier til syntetisering af cykliske peptider for at fremme deres anvendelse inden for lægemiddelopdagelse. Dette papir rapporterer en detaljeret protokol for effektiv syntese af cykliske peptider ved anvendelse af on-harpiks eller intramolekylær (intermolekylær) bisalkylering. Ved hjælp af denne protokol blev lineære peptider syntetiseret ved at drage fordel af fastfasepeptidsyntese med cystein (Cys) og methionin (Met) koblet samtidigt på harpiksen. Endvidere blev cykliske peptider syntetiseret via bisalkylering mellem Met og Cys ved hjælp af en indstillelig tether og et on-tether sulfoniumcenter. Hele den syntetiske rute kan opdeles i tre hovedprocesser: afbeskyttelse af Cys på harpiksen, koblingen af linkeren og cykliseringen mellem Cys og Met i en trifluoreddikesyre (TFA) spaltningsopløsning. Desuden, inspireret af sulfoniumcentrets reaktivitet, blev en propargylgruppe knyttet til Met for at udløse thiol-yne-tilsætning og danne et cyklisk peptid. Derefter blev de rå peptider tørret og opløst i acetonitril, adskilt og derefter renset ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Molekylvægten af det cykliske peptid blev bekræftet af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), og stabiliteten af den cykliske peptidkombination med reduktionsmidlet blev yderligere bekræftet ved anvendelse af HPLC. Derudover blev det kemiske skift i det cykliske peptid analyseret af 1 H kernemagnetisk resonans (1H NMR) spektre. Samlet set havde denne protokol til formål at etablere en effektiv strategi for syntetisering af cykliske peptider.

Introduction

Protein-protein-interaktioner (PPI’er)1 spiller en central rolle i forskning og udvikling af lægemidler. Konstruktion af stabiliserede peptider med en fast konformation ved kemiske midler er en af de vigtigste metoder til udvikling af mimetiske motiver af PPI’er2. Til dato er der udviklet flere cykliske peptider, der er målrettet mod PPI’er til klinisk brug3. De fleste peptider er begrænset til en α-helix-konformation for at mindske konformationsentropien og forbedre den metaboliske stabilitet, målbindende affinitet og cellepermeabilitet 4,5. I de sidste 2 årtier er sidekæderne af Cys 6,7, lysin8,9, tryptophan 10, arginin 11 og Met12,13 blevet indsat i unaturlige aminosyrer for at fiksere peptidet i en cyklisk konformation. Sådanne cykliske peptider kan målrette mod et unikt kemisk rum eller specielle steder og derved udløse en kovalent reaktion for at danne protein-peptidkovalent binding14,15,16,17. I en nylig rapport af Yu et al. blev et chloracetamid forankret på peptidligandernes domæne, hvilket sikrede en kovalent konjugationsreaktion med fremragende proteinspecificitet18. Desuden blev elektrofile sprænghoveder, såsom acrylamid og arylsulfonylfluorid (ArSO2F), yderligere inkorporeret i peptider af Walensky et al.19 for at danne stabiliserede peptidkovalente hæmmere og forbedre antitumoreffekten af peptidhæmmere. Derfor er det meget vigtigt at introducere en yderligere funktionel gruppe for kovalent at ændre protein-peptidligander20. Disse grupper reagerer ikke kun med proteiner på sidekæden, men stabiliserer også den sekundære struktur afpeptidet 21. Anvendelsen af kovalent modificerede proteiner induceret af peptidligander er imidlertid begrænset på grund af den komplicerede syntetiske vej og den ikke-specifikke binding af de kemiske grupper22,23. Der er derfor et presserende behov for effektive strategier til syntese af cykliske peptider.

Inspireret af de mangfoldige strategier for cykliske peptider 2,24,25,26 forsøger denne protokol at udvikle en enkel og effektiv metode til stabilisering af peptider. Derudover bemærkede vi, at sidekædegruppen af et stabilt peptid kunne reagere kovalent med et målprotein, når det var rumligt tæt på peptidliganderne. Manglen på kemisk modificeret Met blev udfyldt af Deming-gruppen i 2013 ved at udvikle en ny metode til fremstilling af selektivt modificeret peptid methionin27. Baseret på denne baggrund fokuserede Shi et al. på udviklingen af ringlukningen af sidekæder for at danne et sulfoniumsaltcenter. Når peptidliganden kombineres med målproteinet, reagerer sulfoniumsaltgruppen kovalent med det rumligt tætte Cys-protein. I de senere år har Shi et al. designet en ny metode til stabilisering af cyklisk peptid28. Sulfoniumsaltet på det cykliske peptid blev reduceret med et reduktionsmiddel med en sulfhydrylgruppe, der blev reversibelt reduceret til Met. Reaktionen havde imidlertid lav effektivitet, hvilket var skadeligt for efterfølgende biologiske applikationsundersøgelser. I den nuværende undersøgelse blev der designet en Met-Cys og propargylbromid-Cys ringlukningsreaktion, hvor et enkelt sulfoniumsalt forblev på sidekæden af det cykliske peptid. Sulfoniumsaltet fungerede som et nyt sprænghoved, der reagerede kovalent med proteinet Cys under rumlig nærhed. Kort fortalt blev et Cys og Met muteret peptid cycliseret ved intramolekylær alkylering, hvilket resulterede i dannelsen af et on-tether sulfoniumcenter. I denne proces var dannelsen af en sidekædebro kritisk for cykliske peptider. Samlet set beskriver denne protokol en detaljeret sulfoniumbaseret peptidcyklisering, der opnås ved hjælp af enkle reaktionsbetingelser og operationer. Målet er at udvikle en potentiel metode til yderligere brede biologiske anvendelser.

Protocol

1. Forberedelse af udstyr FORSIGTIG: Morfolin, N, N-dimethylformamid (DMF), dichlormethan (DCM), N, N-diisopropylethylamin (DIPEA), TFA, morfolin, piperidin, diethylether og methanol er giftige, flygtige og ætsende. Disse reagenser kan skade menneskekroppen gennem indånding, indtagelse eller hudkontakt. Til alle kemiske eksperimenter skal du bruge beskyttelsesudstyr, herunder engangshandsker, eksperimentelle frakker og beskyttelsesbriller. Alle peptidsubstrater kon…

Representative Results

Alle de lineære peptider blev syntetiseret på Rink-amid MBHA-harpiks ved standard manuel Fmoc fastfasesyntese. En model cyklisk hexapeptid (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) blev konstrueret som beskrevet i figur 5A. Især blev et nyt chiralt center genereret af Met-alkylering, med de to epimerer af cyklisk peptid (Ia, Ib) bekræftet af omvendt fase HPLC. Endvidere blev konverteringen og forholdet mellem epimerer bestemt ved hjælp af integrationen af omvendt fase HPLC. Cyklisk Ac-(cyclo…

Discussion

Den syntetiske tilgang, der er beskrevet i dette papir, giver en metode til syntetisering af cykliske peptider ved hjælp af Cys og Met i peptidsekvensen, hvor de grundlæggende lineære peptider konstrueres ved almindelige fastfasepeptidsynteseteknikker. Til bisalkylering af cykliske peptider mellem Cys og Met kan hele den syntetiske rute opdeles i tre hovedprocesser: afbeskyttelse af Cys på harpiksen, koblingen af linkeren og cykliseringen mellem Cys og Met i en trifluoreddikesyrespaltningsopløsning. Især blev fjern…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender økonomisk støtte fra Kinas nationale centrale F &U-program (2021YFC2103900); Natural Science Foundation of China-tilskud (21778009 og 21977010); Naturvidenskabsfonden i Guangdong-provinsen (2022A1515010996 og 2020A1515010521): Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 og JCYJ20200109140406047); og Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions bevilling (2019SHIBS0004). Forfatterne anerkender tidsskriftsstøtte fra Chemical Science, The Royal Society of Chemistry til reference 30 og The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, til reference 31.

Materials

1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography
SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Play Video

Cite This Article
Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

View Video