Summary

On-Tether Sülfonyum Merkezi Kullanarak Döngüsel Peptitlerin Oluşturulması

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, sistein ve metiyonin arasındaki bisalkilasyon yoluyla siklik peptitlerin sentezini ve propargil sülfonyum merkezi tarafından tetiklenen fakil tiol-yne reaksiyonunu sunar.

Abstract

Son yıllarda, siklik peptitler, mükemmel biyolojik aktiviteleri nedeniyle ilaç keşfi alanında giderek daha fazla dikkat çekmektedir ve sonuç olarak, şimdi klinik olarak kullanılmaktadırlar. Bu nedenle, ilaç keşfi alanındaki uygulamalarını teşvik etmek için siklik peptitleri sentezlemek için etkili stratejiler aramak çok önemlidir. Bu yazıda, on-reçine veya intramoleküler (moleküller arası) bisalkilasyon kullanılarak siklik peptitlerin etkin sentezi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol kullanılarak, lineer peptitler, reçine üzerinde aynı anda bağlanmış sistein (Cys) ve metiyonin (Met) ile katı faz peptid sentezinden yararlanılarak sentezlendi. Ayrıca, siklik peptitler, ayarlanabilir bir tether ve bir tether sülfonyum merkezi kullanılarak Met ve Cys arasında bisalkilasyon yoluyla sentezlendi. Tüm sentetik yol üç ana sürece ayrılabilir: reçine üzerindeki Cys’nin korunmasının azaltılması, bağlayıcının bağlanması ve bir trifloroasetik asit (TFA) bölünme çözeltisinde Cys ve Met arasındaki döngüselleşme. Ayrıca, sülfonyum merkezinin reaktivitesinden esinlenerek, tiol-yne ilavesini tetiklemek ve siklik bir peptit oluşturmak için Met’e bir propargil grubu bağlandı. Bundan sonra, ham peptitler kurutuldu ve asetonitril içinde çözüldü, ayrıldı ve daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırıldı. Siklik peptidin moleküler ağırlığı, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile doğrulandı ve indirgeyici ile siklik peptid kombinasyonunun stabilitesi HPLC kullanılarak daha da doğrulandı. Ek olarak, siklik peptitteki kimyasal kayma, 1 H nükleer manyetik rezonans (1H NMR) spektrumu ile analiz edildi. Genel olarak, bu protokol siklik peptitlerin sentezlenmesi için etkili bir strateji oluşturmayı amaçlamıştır.

Introduction

Protein-protein etkileşimleri (PPI’lar)1, ilaç araştırma ve geliştirmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Stabilize peptitlerin kimyasal yollarla sabit bir konformasyonla oluşturulması, PPI’ların mimetik motiflerini geliştirmek için en önemli yöntemlerden biridir2. Bugüne kadar, ÜFE’leri hedef alan birkaç siklik peptit klinik kullanım için geliştirilmiştir3. Çoğu peptit, konformasyonel entropiyi azaltmak ve metabolik stabiliteyi, hedef bağlama afinitesini ve hücre geçirgenliğini iyileştirmek için bir α-sarmal konformasyonu ile sınırlıdır 4,5. Son 2 yılda, Cys6,7, lizin8,9, triptofan 10, arginin 11 ve Met12,13’ün yan zincirleri, peptidi siklik bir konformasyona sabitlemek için doğal olmayan amino asitlere yerleştirilmiştir. Bu tür siklik peptitler benzersiz bir kimyasal alanı veya özel bölgeleri hedefleyebilir, böylece protein-peptit kovalent bağlanması14,15,16,17 oluşturmak için kovalent bir reaksiyonu tetikleyebilir. Yu ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan bir raporda, peptid ligandlarının alanına bir kloroasetamid tutturulmuş ve mükemmel protein özgüllüğü18 ile kovalent bir konjugasyon reaksiyonu sağlanmıştır. Ayrıca, akrilamid ve aril sülfonil florür (ArSO2F) gibi elektrofilik savaş başlıkları, stabilize peptid kovalent inhibitörleri oluşturmak ve peptid inhibitörlerinin anti-tümör etkisini iyileştirmek için Walensky ve ark.19 tarafından peptitlere daha fazla dahil edilmiştir. Bu nedenle, protein-peptid ligandlarını kovalent olarak modifiye etmek için ek bir fonksiyonel grup tanıtmak çok önemlidir20. Bu gruplar sadece yan zincirdeki proteinlerle reaksiyona girmekle kalmaz, aynı zamanda peptid21’in ikincil yapısını da stabilize eder. Bununla birlikte, peptid ligandları tarafından indüklenen kovalent modifiye proteinlerin uygulanması, karmaşık sentetik yol ve kimyasal grupların spesifik olmayan bağlanması nedeniyle sınırlıdır22,23. Bu nedenle, siklik peptitlerin sentezi için etkili stratejiler acilen gereklidir.

2,24,25,26 siklik peptitlerin çok yönlü stratejilerinden esinlenen bu protokol, peptitleri stabilize etmek için basit ve etkili bir yöntem geliştirmeye çalışır. Ek olarak, kararlı bir peptidin yan zincir grubunun, peptid ligandlarına mekansal olarak yakın olduğunda bir hedef protein ile kovalent olarak reaksiyona girebileceğini belirttik. Kimyasal olarak modifiye edilmiş Met’in eksikliği, 2013 yılında Deming grubu tarafından, seçici olarak modifiye edilmiş peptid metiyonin27 üretmek için yeni bir yöntem geliştirilerek dolduruldu. Bu arka plana dayanarak, Shi ve ark. bir sülfonyum tuz merkezi oluşturmak için yan zincirlerin halka kapanmasının geliştirilmesine odaklandı. Peptit ligandı hedef protein ile birleştiğinde, sülfonyum tuzu grubu, mekansal olarak yakın Cys proteini ile kovalent olarak reaksiyona girer. Son yıllarda, Shi ve ark. siklik peptid28’i stabilize etmek için yeni bir yöntem tasarladılar. Siklik peptit üzerindeki sülfonyum tuzu, geri dönüşümlü olarak Met’e indirgenmiş bir sülfhidril grubuna sahip bir indirgeyici ajan tarafından indirgenmiştir. Bununla birlikte, reaksiyon düşük verimliliğe sahipti ve bu da sonraki biyolojik uygulama çalışmalarına zararlıydı. Bu çalışmada, siklik peptidin yan zincirinde kalan tek bir sülfonyum tuzu ile bir Met-Cys ve propargil bromür-Cys halka kapatma reaksiyonu tasarlanmıştır. Sülfonyum tuzu, uzaysal yakınlık altında Cys proteini ile kovalent olarak reaksiyona giren yeni bir savaş başlığı görevi gördü. Kısaca, bir Cys ve Met mutasyona uğramış peptid, molekül içi alkilasyon ile siklize edildi ve bu da bir on-tether sülfonyum merkezinin üretilmesiyle sonuçlandı. Bu süreçte, bir yan zincir köprüsünün oluşumu siklik peptitler için kritik öneme sahipti. Genel olarak, bu protokol, basit reaksiyon koşulları ve işlemleri kullanılarak elde edilen ayrıntılı bir sülfonyum bazlı peptid siklizasyonunu tanımlar. Amaç, daha geniş biyolojik uygulamalar için potansiyel bir yöntem geliştirmektir.

Protocol

1. Ekipman hazırlığı DİKKAT: Morfolin, N, N-dimetilformamid (DMF), diklorometan (DCM), N, N-diizopropilelamin (DIPEA), TFA, morfolin, piperidin, dietil eter ve metanol toksik, uçucu ve aşındırıcıdır. Bu reaktifler insan vücuduna soluma, yutma veya cilt teması yoluyla zarar verebilir. Tüm kimyasal deneyler için, tek kullanımlık eldivenler, deneysel paltolar ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere koruyucu ekipman kullanın. Rink-amid 4-metilbenzhi…

Representative Results

Tüm lineer peptitler, standart manuel Fmoc katı faz sentezi ile Rink-amid MBHA reçinesi üzerinde sentezlendi. Şekil 5A’da açıklandığı gibi bir model siklik hekzapeptid (Ac (siklo-I)-WMAAAC-NH2) inşa edilmiştir. Özellikle, Met alkilasyonu ile yeni bir on-tether kiral merkezi üretildi ve siklik peptidin iki epimeri (Ia, Ib) ters faz HPLC tarafından doğrulandı. Ayrıca, epimerlerin dönüşümü ve oranı, ters faz HPLC’nin entegrasyonu kullanılarak belirlendi. Hekz…

Discussion

Bu yazıda açıklanan sentetik yaklaşım, temel lineer peptitlerin ortak katı faz peptid sentez teknikleri ile oluşturulduğu peptid dizisinde Cys ve Met kullanarak siklik peptidlerin sentezlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Cys ve Met arasındaki siklik peptitlerin bisalkilasyonu için, tüm sentetik yol üç ana sürece ayrılabilir: reçine üzerindeki Cys’nin korunmasının azaltılması, bağlayıcının bağlanması ve bir trifloroasetik asit bölünme çözeltisinde Cys ve Met arasındaki siklikleşme. Ö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı’nın (2021YFC2103900) finansal desteğini kabul ediyoruz; Çin Doğa Bilimleri Vakfı hibe (21778009 ve 21977010); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022A1515010996 ve 2020A1515010521): Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komitesi, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 ve JCYJ20200109140406047); ve Shenzhen-Hong Kong Beyin Bilimi Enstitüsü-Shenzhen Temel Araştırma Kurumları hibesi (2019SHIBS0004). Yazarlar, referans 30 için Chemical Science, The Royal Society of Chemistry ve referans 31 için The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society’den dergi desteğini kabul etmektedir.

Materials

1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography
SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Play Video

Cite This Article
Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

View Video