Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum
Summary
Dieses Protokoll stellt die Synthese zyklischer Peptide durch Bisalkylierung zwischen Cystein und Methionin und die einfache Thiol-In-Reaktion dar, die durch das Propargylsulfoniumzentrum ausgelöst wird.
Abstract
In den letzten Jahren haben zyklische Peptide aufgrund ihrer hervorragenden biologischen Aktivitäten zunehmend Aufmerksamkeit im Bereich der Wirkstoffforschung erregt und werden daher klinisch eingesetzt. Es ist daher wichtig, effektive Strategien für die Synthese zyklischer Peptide zu suchen, um ihre Anwendung im Bereich der Wirkstoffforschung zu fördern. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die effiziente Synthese zyklischer Peptide unter Verwendung von Harz- oder intramolekularer (intermolekularer) Bisalkylierung. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden lineare Peptide synthetisiert, indem die Festphasenpeptidsynthese mit Cystein (Cys) und Methionin (Met) gleichzeitig auf dem Harz gekoppelt wurde. Ferner wurden cyclische Peptide durch Bisalkylierung zwischen Met und Cys unter Verwendung eines abstimmbaren Tether und eines On-Tether-Sulfoniumzentrums synthetisiert. Die gesamte Syntheseroute kann in drei Hauptprozesse unterteilt werden: die Deprotection von Cys auf dem Harz, die Kopplung des Linkers und die Cyclisierung zwischen Cys und Met in einer Trifluoressigsäure (TFA) -Spaltlösung. Darüber hinaus wurde, inspiriert von der Reaktivität des Sulfoniumzentrums, eine Propargylgruppe an das Met gebunden, um die Thiol-In-Addition auszulösen und ein zyklisches Peptid zu bilden. Danach wurden die Rohpeptide getrocknet und in Acetonitril gelöst, getrennt und anschließend mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Das Molekulargewicht des cyclischen Peptids wurde durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) bestätigt, und die Stabilität der cyclischen Peptidkombination mit dem Reduktionsmittel wurde weiter mittels HPLC bestätigt. Zusätzlich wurde die chemische Verschiebung im cyclischen Peptid mittels 1 H Kernspinresonanz (1H NMR) Spektren analysiert. Insgesamt zielte dieses Protokoll darauf ab, eine effektive Strategie für die Synthese zyklischer Peptide zu etablieren.
Introduction
Protein-Protein-Interaktionen (PPI)1 spielen eine zentrale Rolle in der Arzneimittelforschung und -entwicklung. Die Konstruktion stabilisierter Peptide mit fester Konformation durch chemische Mittel ist eine der wichtigsten Methoden zur Entwicklung mimetischer Motive von PPI2. Bisher wurden mehrere zyklische Peptide, die auf PPI abzielen, für den klinischen Einsatz entwickelt3. Die meisten Peptide sind auf eine α-Helix-Konformation beschränkt, um die Konformationsentropie zu verringern und die metabolische Stabilität, Zielbindungsaffinität und Zellpermeabilität zu verbessern 4,5. In den letzten 2 Jahrzehnten wurden die Seitenketten von Cys 6,7, Lysin8,9, Tryptophan 10, Arginin 11 und Met12,13 in unnatürliche Aminosäuren eingefügt, um das Peptid in eine zyklische Konformation zu fixieren. Solche zyklischen Peptide können auf einen einzigartigen chemischen Raum oder spezielle Stellen abzielen und dadurch eine kovalente Reaktion auslösen, um eine kovalente Protein-Peptid-Bindung14,15,16,17 zu bilden. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht von Yu et al. wurde ein Chloracetamid in der Domäne von Peptidliganden verankert, was eine kovalente Konjugationsreaktion mit ausgezeichneter Proteinspezifität gewährleistet18. Darüber hinaus wurden elektrophile Gefechtsköpfe wie Acrylamid und Arylsulfonylfluorid (ArSO2F) von Walensky et al.19 weiter in Peptide eingebaut, um stabilisierte kovalente Peptidinhibitoren zu bilden und die Antitumorwirkung von Peptidinhibitoren zu verbessern. Daher ist es sehr wichtig, eine zusätzliche funktionelle Gruppe einzuführen, um Protein-Peptid-Liganden kovalent zu modifizieren20. Diese Gruppen reagieren nicht nur mit Proteinen auf der Seitenkette, sondern stabilisieren auch die Sekundärstruktur des Peptids21. Die Anwendung kovalent modifizierter Proteine, die durch Peptidliganden induziert werden, ist jedoch aufgrund des komplizierten Syntheseweges und der unspezifischen Bindung der chemischen Gruppen22,23 begrenzt. Effektive Strategien zur Synthese zyklischer Peptide sind daher dringend erforderlich.
Inspiriert von den vielfältigen Strategien der zyklischen Peptide 2,24,25,26 versucht dieses Protokoll, eine einfache und effiziente Methode zur Stabilisierung von Peptiden zu entwickeln. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Seitenkettengruppe eines stabilen Peptids kovalent mit einem Zielprotein reagieren konnte, wenn es räumlich nahe an den Peptidliganden war. Der Mangel an chemisch modifiziertem Met wurde 2013 von der Deming-Gruppe durch die Entwicklung einer neuartigen Methode zur Herstellung des selektiv modifizierten Peptids Methionin27 behoben. Vor diesem Hintergrund konzentrierten sich die Shi et al. auf die Entwicklung des Ringverschlusses von Seitenketten zu einem Sulfoniumsalzzentrum. Wenn sich der Peptidligand mit dem Zielprotein verbindet, reagiert die Sulfoniumsalzgruppe kovalent mit dem räumlich nahen Cys-Protein. In den letzten Jahren haben Shi et al. eine neue Methode zur Stabilisierung des zyklischen Peptids28 entwickelt. Das Sulfoniumsalz auf dem cyclischen Peptid wurde durch ein Reduktionsmittel mit einer Sulfhydrylgruppe reduziert, die reversibel zu Met reduziert wurde. Die Reaktion hatte jedoch eine geringe Effizienz, was für nachfolgende biologische Anwendungsstudien schädlich war. In der aktuellen Studie wurde eine Met-Cys- und Propargybromid-Cys-Ringschlussreaktion entworfen, bei der ein einzelnes Sulfoniumsalz auf der Seitenkette des cyclischen Peptids verbleibt. Das Sulfoniumsalz fungierte als neuer Gefechtskopf, der in räumlicher Nähe kovalent mit dem Protein Cys reagierte. Kurz gesagt, ein Cys- und Met-mutiertes Peptid wurde durch intramolekulare Alkylierung zyklisiert, was zur Erzeugung eines On-Tether-Sulfoniumzentrums führte. In diesem Prozess war die Bildung einer Seitenkettenbrücke entscheidend für cyclische Peptide. Insgesamt beschreibt dieses Protokoll eine detaillierte sulfoniumbasierte Peptidcyclisierung, die unter einfachen Reaktionsbedingungen und Operationen erreicht wird. Ziel ist es, eine mögliche Methode für weitere breite biologische Anwendungen zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der in diesem Artikel beschriebene synthetische Ansatz bietet eine Methode zur Synthese zyklischer Peptide unter Verwendung von Cys und Met in der Peptidsequenz, in der die grundlegenden linearen Peptide durch gängige Festphasen-Peptidsynthesetechniken aufgebaut werden. Für die Bisalkylierung von cyclischen Peptiden zwischen Cys und Met kann die gesamte Syntheseroute in drei Hauptprozesse unterteilt werden: die Deprotection von Cys auf dem Harz, die Kopplung des Linkers und die Cyclisierung zwischen Cys und Met in eine…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der finanziellen Unterstützung durch das National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); die Zuschüsse der Natural Science Foundation of China (21778009 und 21977010); die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2022A1515010996 und 2020A1515010521): das Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 und JCYJ20200109140406047); und das Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions Stipendium (2019SHIBS0004). Die Autoren bestätigen die Unterstützung der Zeitschrift durch Chemical Science, die Royal Society of Chemistry für Referenz 30 und das Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, für Referenz 31.
Materials
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
| 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
| 2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
| 6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
| Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
| Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
| Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
| Formic acid | Energy | W810042 | |
| High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
| Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
| Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
| Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
| Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
| Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
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