Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Gnavermodel af intestinal iskæmi-reperfusionsskade via okklusion af den overlegne mesenteriske arterie

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/64314
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3
1Animal Surgery and Resources Core, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, 3Division of Veterinary Resources, Office of Research Services, National Institutes of Health

Summary

Vi beskriver, hvordan man genererer en udbredt kirurgisk model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade (IRI) hos gnavere. Proceduren indebærer okklusion af den overlegne mesenteriske arterie efterfulgt af genoprettelse af blodgennemstrømningen. Denne model er nyttig til undersøgelser, der undersøger okklusive årsager til intestinal IRI i både veterinær- og humanmedicin.

Abstract

Intestinal iskæmi-reperfusionsskade (IRI) er forbundet med et utal af tilstande inden for både veterinær- og humanmedicin. Intestinale IRI-tilstande, såsom gastrisk dilatation volvulus (GDV), mesenterisk torsion og kolik, observeres hos dyr som hunde og heste. En indledende afbrydelse af blodgennemstrømningen får væv til at blive iskæmisk. Selvom det er nødvendigt for at redde levedygtigt væv, kan efterfølgende reperfusion fremkalde yderligere skade. Den vigtigste mekanisme, der er ansvarlig for IRI, er dannelse af frie radikaler ved reperfusion og genindførelse af ilt i beskadiget væv, men der er mange andre komponenter involveret. De resulterende lokale og systemiske virkninger giver ofte en dårlig prognose.

Intestinal IRI har været genstand for omfattende forskning i løbet af de sidste 50 år. En in vivo gnavermodel, hvor basen af den overlegne mesenteriske arterie (SMA) midlertidigt ligeres, er i øjeblikket den mest almindelige metode, der anvendes til at studere intestinal IRI. Her beskriver vi en model af intestinal IRI ved hjælp af isofluranbedøvelse i 21%O2 medicinsk luft, der giver reproducerbar skade, som demonstreret ved konsekvent histopatologi af tyndtarmen. Vævsskade blev også vurderet i tyktarmen, leveren og nyrerne.

Introduction

Iskæmi-reperfusionsskade (IRI) kan forekomme i ethvert organ og involverer to sekventielle komponenter. En indledende ophør af blodgennemstrømningen får berørte væv til at blive iskæmisk og derefter efterfølgende reperfusion inducerer yderligere celleskade. Skader fra reperfusionen overstiger ofte skader forårsaget af iskæmi1. IRI's patofysiologi involverer en kompleks kaskade af begivenheder, hvoraf den mest bemærkelsesværdige er dannelse af frie radikaler ved genindførelse af ilt, som forekommer under reperfusion2. Aktivering af de inflammatoriske celler og cytokiner spiller også en rolle2. I tilfælde af intestinal IRI kan bakteriel translokation i blodbanen efter endotelskader føre til systemisk inflammatorisk responssyndrom2. Hvis skaden på grund af IRI er alvorlig nok, kan resulterende systemiske virkninger føre til multiorgansvigt3.

Tilfælde af intestinal IRI er forbundet med høj sygelighed og dødelighed 4,5,6. Intestinal IRI er forbundet med mange patologiske tilstande og kirurgiske procedurer inden for både veterinær- og humanmedicin. I veterinærmedicin er dyr særligt tilbøjelige til intestinale IRI-tilstande, såsom gastrisk dilatation volvulus (GDV), mesenterisk torsion og kolik 7,8. Hos mennesker er IRI et stort og hyppigt forekommende problem ved abdominal aortaaneurismekirurgi, stranguleret brok, akut mesenterisk iskæmi, volvulus, traume, chok, neonatal nekrotiserende enterocolitis og tyndtarmsresektion eller transplantation9.

De fleste in vivo gnaverundersøgelser af intestinal IRI involverer okklusion af basen af den overlegne mesenteriske arterie (SMA), grenen af abdominal aorta, der leverer blod til størstedelen af tyndtarmen og den proksimale del af tyktarmen 10,11,12. På trods af denne models udbredte anvendelse og relative enkelhed er en detaljeret protokol, der bruger inhalationsanæstesi i 21%O2 medicinsk luft, ikke blevet offentliggjort. Manglen på en standardprotokol udgør vanskeligheder for forskere, der ikke er bekendt med proceduren og forhindrer konsistens på tværs af undersøgelser. Vi demonstrerer de nødvendige trin for at udføre den kirurgiske model af intestinal IRI i 8-14 uger gamle mandlige og kvindelige schweiziske Webster-mus. Denne model af intestinal IRI giver reproducerbar skade, som demonstreret ved konsekvent histopatologi.

Protocol

De procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee ved National Institutes of Health og er i overensstemmelse med de politikker, der er skitseret i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, The Animal Welfare Act og Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Kirurgisk opsætning

  1. Følg aseptiske procedurer. Don en maske, hårdæksel og ren jumpsuit / lab frakke / kirurgiske skrubber.
  2. Forbered følgende steriliserede materialer: kirurgiske instrumenter (se materialetabel), varmt saltvand, vatpinde, gasbind, kirurgiske hæfteklammer, kirurgiske gardiner og handsker. Få også kirurgisk tape, som ikke behøver at blive steriliseret. Steriliser materialerne med enten autoklave- eller ethylenoxidsteriliseringsteknikker.
  3. Placer et opvarmet cirkulerende vandtæppe i operationsområdet og dæk det med et sterilt håndklæde eller drapering.
  4. Brug en præcisionsisofluranfordamper, tryksat medicinsk luft (21%O2) og et Bain ikke-rebreathing-kredsløb med en næsekegle designet til mus til at give kirurgisk anæstesi.

2. Tilberedning af dyr

  1. Bedøv musen i et induktionskammer ved at levere 2% -4% isofluran med 21%O2 medicinsk luft med en hastighed på 0,5 l / min for hver liter kammervolumen.
    BEMÆRK: Det foretrækkes at bruge 21%O2 medicinsk luft over 100%O2 til denne særlige model, da mætning af blodet medO2 kan forstyrre IRI.
  2. Fjern musen fra kammeret og flyt den til en ren overflade adskilt fra operationsområdet. Tilpas den med en næsekegle, der leverer 1,5% isofluran med 21%O2 medicinsk luft.
  3. Der injiceres 1 mg/kg buprenorphin subkutant i det dorsale cervicothoracale område.
  4. Injicer 200-600 IE/kg heparin intraperitonealt for at forhindre dannelse af trombose i okklusionsperioden.
  5. Påfør oftalmisk salve til øjnene for at forhindre hornhindeskader.
  6. Fjern hår fra den ventrale mave ved hjælp af klippere.
  7. Flyt musen over på det opvarmede vandtæppe i operationsområdet. Igen skal du montere den med en næsekegle, der leverer 1,5% isofluran med 21%O2 medicinsk luft for at opnå et kirurgisk anæstesiplan.
  8. Placer musen i dorsal liggende og fastgør lemmerne til bordet med kirurgisk tape.
  9. Overvåg dyrets kropstemperatur rektalt ved hjælp af et gnaverspecifikt termometer. Hold kropstemperaturen på 36,5 ± 0,5 °C under hele operationen.
  10. Desinficer den ventrale mave ved hjælp af sterilt gaze gennemblødt i enten chlorhexidinskrubbe eller povidon-jodskrubbe, efterfulgt af 70% alkohol. Gentag denne sekvens tre gange, skiftevis mellem skrubben og alkoholen. Et nyt sæt skrubber og alkoholgazer skal bruges hver gang.
    1. Påfør skrubben og alkoholen i en cirkulær bevægelse, startende med små cirkler i midten af det kirurgiske sted og gradvist arbejder mod kanterne ved at øge størrelsen på cirklerne. Kassér gazen, når kanten af det kirurgiske sted er nået. Skrub ikke bagud fra kant til midte.
  11. Udfør en tåklemmetest (pedalrefleks) for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet.
  12. Don sterile handsker. Aseptisk draperer det kirurgiske sted.

3. Kirurgi og iskæmi

  1. Lav et 3-5 cm ventralt midterlinie abdominal snit i huden ved hjælp af et # 15 skalpelblad, disseker det fri for den underliggende muskelfascia og reflekter det sideværts. Fortsæt snittet gennem bugvæggen langs linea alba ved hjælp af enten mikrodissekerende saks eller fjederbelastet mikrosaks og placer en retraktor på plads.
  2. Placer sterile gazebind puder fugtet med varm steril saltvand omkring operationsområdet.
  3. Fjern tyndtarmen fra bukhulen, vend den kranielt og til dyrets venstre side, og læg den på de fugtede puder. Placer en anden fugtet gazepude over vævene for at forhindre udtørring. Dryp regelmæssigt varmt sterilt saltvand på gasbindet for at holde vævene fugtige.
  4. Isoler SMA, som er placeret ventral til den ringere vena cava, kaudal til cøliakiarterien og kranial til nyrearterien.
    BEMÆRK: Figur 1 viser placeringen af SMA, hvor den er isoleret under operationen. SMA ligger normalt ventral til den ringere vena cava og strækker sig mod højre. Når tarmene er eksteriøriseret og vendt til venstre under operationen, ligger SMA til venstre for den ringere vena cava.
  5. Placer et atraumatisk mikrovaskulært klip over bunden af SMA, hvor det forgrener sig fra abdominal aorta, hvilket sikrer, at klemmen ikke blokerer den overlegne mesenteriske vene.
  6. Kontroller tyndtarmens iskæmi ved at bemærke farveændringen fra lyserød til bleghvid og tabet af mesenterisk pulsering.
  7. Sæt indvoldene tilbage til sin oprindelige position inde i bukhulen i løbet af den iskæmiske periode. Fjern tilbagetrækningen og dæk snittet med fugtigt gasbind. Tilsæt regelmæssigt varmt sterilt saltvand til gasbindet for at forhindre udtørring og opretholde kropstemperaturen.
  8. Efter en periode på 45 minutter med iskæmi (hvis begyndelse er markeret ved den første anvendelse af klippet), skal du fjerne det okkluderende klip. Kontroller genoprettelsen af blodgennemstrømningen ved at observere en mesenterisk pulsering og skyllet farve.
  9. Påfør varmt sterilt saltvand intraperitonealt lige før endelig lukning for at opretholde passende hydrering.
  10. Luk mavemusklerne med en 6-0 polyglactin 910 sutur. Administrer bupivacain (op til 2 mg/kg) langs muskelsnitlinjen til smertelindring. Luk huden med kirurgiske hæfteklammer eller sårklip.

4. Genopretning og reperfusion

  1. Sæt musen tilbage i et varmt kammer eller bur på et cirkulerende vandtæppe, håndvarmer eller anden passende varmekilde. Lever 21%O2 ved en strømningshastighed på 0,5 l / min for hver liter kammervolumen. Lad musen komme sig her i 90 min. Overvåg musen hvert 5.-10. minut for tegn på smerte eller nød, såsom krumbøjet kropsholdning, skævhed og modvilje mod at bevæge sig.

5. Eutanasi og blodindsamling

  1. Ved afslutningen af 90 minutters restitutionsperioden sættes musen tilbage i induktionskammeret og afleveres 2-4 % isofluran med 21 %O2 med en hastighed på 0,5 l/min kammervolumen for at geninducere fuld bedøvelse.
  2. Overfør dyret tilbage til operationsområdet og monter det med en næsekegle, der leverer 2% -4% isofluran med 21%O2 for at opnå dyb anæstesi.
    BEMÆRK: CO2 er ikke en passende metode til eutanasi til denne procedure, da det inducerer fysiologiske ændringer, som kan forstyrre iskæmisk skade eller vævsanalysander13.
  3. Åbn det ventrale midterlinjesnit igen og udfør en terminal blødning ved at opsamle så meget blod som muligt fra den abdominale vena cava ved hjælp af en 23 G nål og sprøjte. Forvent at indsamle mellem 0,3-0,5 ml blod (mindre hos mus, der har gennemgået IRI, mere hos dem, der fik falsk laparotomi).
    BEMÆRK: Formålet med terminalblødningen er at hjælpe med human eutanasi og at indsamle og bevare blod til fremtidig test (dvs. serumkemi, PCR, ELISA).
  4. Efter blodindsamling afbrydes abdominal aorta for at muliggøre fuldstændig ekssanguination.
  5. Udfør enten cervikal dislokation eller thoracotomi som en sekundær foranstaltning for at sikre vellykket eutanasi.

6. Vævsbehandling til histologi

  1. Efter eutanasi skal du samle de ønskede væv. Sørg for, at vævsbehandlingen udføres straks, da autolyse begynder umiddelbart efter døden14,15.
    1. Tarme: Saml hele tyndtarmens og tyktarmens længde. Kassér cecum.
    2. Lever: Saml venstre laterale, venstre median og højre median lobes.
    3. Nyrer: Saml begge nyrer. Ved konvention skæres venstre nyre i længderetningen, og højre skæres som et tværsnit på obduktionstidspunktet.
      BEMÆRK: Tyktarmen, leveren og nyrerne kan anvendes til vurdering af multiorgansvigt eller andre systemiske virkninger af IRI. Tyndtarmen bruges til at vurdere den primære skade. Det er ikke nødvendigt at holde styr på individuelle sektioner af leveren lap og nyrer, da hvert organ vil blive analyseret og scoret som en enhed. Tarmsegmenterne skal dog holdes adskilt og derefter mærkes og scores individuelt.
  2. Opdel tarmen i fire sektioner: tolvfingertarmen, jejunum, ileum og tyktarm. Sørg for, at de tre tyndtarmssegmenter er lige lange. Gør dette ved at folde tyndtarmen i en "Z" -form, hvor den øverste linje er tolvfingertarmen, midterlinjen er jejunum, og bundlinjen er ileum. Det er vigtigt at holde styr på den proksimale versus den distale ende.
  3. Tarmsegmenternes lumen skylles med saltvand ved hjælp af en 10 ml sprøjte fastgjort med et 20 G angiokateter.
  4. Før du laver sektioner, skal du lægge hvert tarmsegment fladt med den luminale side opad. Brug en 3 ml sprøjte fastgjort med en 27 G nål og påfør generøst 10% bufret formalin dråbevis for at belægge hele slimhindens længde. Rul derefter hvert tarmsegment individuelt og læg det i separate, mærkede vævskassetter.
    1. For at rulle skal du lægge hvert segment fladt med den lysende side opad og derefter rulle rundt om en tandstikker. Den proksimale del skal danne den indre del af rullen. Lumen skal vende mod indersiden / midten. Prøv at rulle så forsigtigt som muligt for at undgå at komprimere villi.
    2. Når den rulles, skal tarmen ligne en schweizisk rulle. Placer den schweiziske rullespiral med forsiden opad inde i kassetten.
  5. Placer vævene i mærkede hætteglas fyldt med 10% bufret formalin for at fiksere dem ved stuetemperatur. Overfiksering er bedre end underfiksering. Hætteglassene skal være store med masser af formalin - mindst 20x mere fikserende end væv.
    1. Tarme: Placer de fire kassetter sammen i en prøvekop. Fix til 24-48 timer.
    2. Lever: Placer leverlapperne sammen i et 50 ml konisk rør. Fix til 24-48 timer.
    3. Nyrer: Placer nyrerne sammen i et 50 ml konisk rør. Fix til 48-72 timer.
      BEMÆRK: Utrimmede nyrer tager længere tid at reparere end trimmede nyrer. For at forkorte fikseringstiden til 24-48 timer kan nyrerne skæres langs medianplanet, i længderetningen (venstre nyre) og på tværs (højre nyre) og anbringes i kassetter, inden de deponeres i formalinet.
  6. Efter at vævene er blevet fastgjort i formalin i den angivne tid, skylles med fosfatbufret saltvand (PBS) eller destilleret vand og overføres til mærkede hætteglas fyldt med 70% EtOH. Vævet kan opbevares i EtOH på ubestemt tid ved stuetemperatur, mens man afventer histologi.
    1. Tarme: Placer de fire kassetter sammen i en prøvekop.
    2. Lever: Placer leverlapperne sammen i et 50 ml konisk rør.
    3. Nyrer: Placer nyrerne sammen i et 50 ml konisk rør.
  7. Når du er klar, skal vævene behandles på glasglas ved hjælp af hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning. Trim de formalinfikserede væv og indlejr dem derefter i paraffin. Monter fem mikron sektioner på diasene og pletter med H&E.

7. Vævsscore

  1. Vævsscoring bør fortrinsvis udføres af erfarent personale, der er blindet for prøvegrupperne.
  2. Intestinal iskæmi scores ved hjælp af Chiu / Park scoringssystem17.
  3. Nyreskade scores ved hjælp af Jablonski scoringssystemet18,19.
  4. Leverskader scores ved hjælp af Suzuki-scoringssystemet20,21.
    BEMÆRK: Der er mange scoringssystemer, der i øjeblikket er i brug til vurdering af vævsskade i gnavermodeller af intestinal IRI. De scoringssystemer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev valgt for at minimere vilkårlig estimering og for at maksimere forsætlig kvalitativ vurdering (tabel 1).

Representative Results

Vi demonstrerede en model af intestinal IRI i mus, der gav konsistente og reproducerbare resultater. Tyndtarmen, proksimal tyktarm, nyrer og lever blev sektioneret og farvet med H &E. En veterinærpatolog klassificerede vævsskade ved hjælp af de tidligere nævnte scoringssystemer (tabel 1). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af enkeltfaktorvariansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys post hoc med parvise sammenligninger, som fastslog, om der var en signifikant forskel i dataene inden for og på tværs af grupper. En p-værdi mindre end eller lig med 0,05 blev betragtet som cutoff for at fastslå statistisk signifikans. Alle statistiske tests og graftegninger blev udført i et regnearksprogram (f.eks. Microsoft Excel) med tilføjelsesprogrammet Real Statistics Resource Pack. Data præsenteres som middelværdien ± standardfejlen for middelværdien (SEM).

Mikroskopisk læsionsscore for de tre tyndtarmssegmenter (tolvfingertarmen, jejunum og ileum) blev signifikant øget for dyr, der gennemgik intestinal iskæmi-reperfusionsskade (IRI; N = 7) versus dem, der gennemgik falsk laparotomi (Sham; n = 6) (figur 2 og figur 3). Standardfejlen for disse data var snæver, hvilket viste konsistens i resultaterne inden for og på tværs af grupper. Hvert tarmsegment i Sham-gruppen gav nøjagtig den samme gennemsnitlige Park/Chiu-score på 0,83. SEM for tolvfingertarmen, jejunum og ileum i Sham-gruppen var henholdsvis 0,31, 0,40 og 0,31. Den gennemsnitlige Park/Chiu score for tolvfingertarmen, jejunum og ileum i IRI gruppen var henholdsvis 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 og 5,14 ± 0,40.

I denne undersøgelse døde 50% (3/6) af de oprindelige mus, der gennemgik 60 minutters iskæmi og 120 minutters reperfusion (60/120 gruppe). To af de tre mus blev indsendt til obduktion. Begge mus havde epitelnekrose, overbelastning og blødning i tyndtarmen. Derudover havde musene lymfocytolyse, en uspecifik ændring forbundet med fysiologisk stress. Ingen af musene havde læsioner i hjertet, lungen, leveren eller nyrerne. Forkortelse af tiderne til 45 minutters iskæmi og 90 minutters reperfusion og tilføjelse af 400 IE / kg heparin (45/90 / H-gruppe) sænkede dødeligheden til 20% (1/5) uden at ændre tarmskadescorerne (figur 4). Den gennemsnitlige Park/Chiu-score for 60/120-gruppen var 4,56 ± 0,38 (N = 3), og den gennemsnitlige score for 45/90/H-gruppen var 4,375 ± 0,38 (N = 4).

Mikroskopiske fund, der tyder på skade i den proksimale tyktarm, lever og nyre, blev ikke set hos hverken 60/120 mus eller 45/90/H mus.

Tabel 1: Scoringssystemer for tarme, nyrer og lever. Tarmskader blev klassificeret ved hjælp af Chiu / Park-systemet17. Nyreskade blev klassificeret ved hjælp af Jablonski scoringssystemet18,19. Leverskader blev klassificeret ved hjælp af Suzuki-scoringssystemet20,21. Denne tabel er tilpasset med tilladelser fra scoringssystemer præsenteret i Quaedackers et al.17, Du et al.19 og Behrends et al.21. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1: Placering og isolering af den overordnede mesenteriske arterie (SMA). (A) Normalt ligger SMA ventral til den ringere vena cava og strækker sig mod dyrets højre side. Det ligger mellem cøliakiarterien og nyrearterien. Denne figur er tilpasset med tilladelse fra The Anatomy of the Laboratory Mouse af Margaret Cook (1965)22. (B) I denne procedure er tarmene udvendig og vendt til venstre (dækket med fugtet gaze på dette billede), så SMA (gul pil) ligger til venstre for den ringere vena cava (blå pil). Forkortelser: RK = højre nyre; D = tolvfingertarmen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Små tarmsegmenter farvet med hæmatoxylin og eosin. Sektioner af jejunum (A) og ileum (B) fra mus i Sham-gruppen indeholdt villi, der var lange og tynde uden forvrængning. Sektioner af jejunum (C) og ileum (D) fra mus i IRI-gruppen indeholdt områder med nekrose (stjerner) og blødning med stumpning og forvrængning af de resterende villi (pile). Billederne er fra mus, der gennemgik 45 min iskæmi og 90 min reperfusion og modtog 400 IE / kg heparin. Billederne blev taget med 20x forstørrelse med 10% zoom. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Park/Chiu scorer for tyndtarmssegmenter. Mikroskopisk skade på alle tre tarmsegmenter (tolvfingertarmen, jejunum og ileum) hos dyr, der gennemgik intestinal iskæmi-reperfusionsskade (IRI) blev signifikant øget sammenlignet med dem, der gennemgik falsk laparotomi (Sham). * p < 0,05 for IRI versus Sham. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Park/Chiu score for tyndtarm gennemgår 60 min iskæmi og 120 reperfusion versus 45 min iskæmi og 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin. At reducere tiderne fra 60 min iskæmi og 120 min reperfusion (60/120) til 45 min iskæmi og 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin (45/90/H) skabte ikke en statistisk signifikant forskel i Park/Chiu skadescore for tyndtarmen hos mus i IRI-gruppen. Det reducerede dog dødeligheden fra 50% til 20%. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

På trods af den udbredte anvendelse af denne intestinale IRI-model er den ikke uden sine begrænsninger. For eksempel forhindrer eneste okklusion af bare bunden af SMA ikke blodgennemstrømningen til tarmen fuldstændigt. Dette skyldes sandsynligvis omfattende sikkerhedscirkulation i mesenteriet, som kan trække blod fra nabogrene af abdominal aorta. I en undersøgelse hos katte nedsatte SMA-okklusion blodgennemstrømningen med 35% i det proksimale tolvfingertarm, 61% i det distale tolvfingertarm, 71% i jejunum og ileum og 63% i det proksimale kolon. Blodgennemstrømningen blev ikke reduceret i den midterste og distale tyktarm, som modtager meget af deres cirkulation fra den ringere mesenteriske arterie23. Hos gnavere nævnes jejunum og ileum oftest som de tarmsegmenter, der pådrager sig den mest betydningsfulde vævsskade efter SMA-okklusion9.

En bred vifte af iskæmitider efter SMA-okklusion er blevet citeret i litteraturen, fra 1 til 90 min eller mere. Forskellige iskæmiske tider resulterer i forskellige niveauer af reperfusionsskade; Park et al. observerede reperfusionsskade, når det iskæmiske interval var mellem 40 og 60 minutter, men ikke når det iskæmiske interval var kortere eller længere24. Sådanne resultater tyder på, at kortere tider ikke producerer nok iskæmi til at tilskynde reperfusionsskade, mens længere tider beskadiger vævet så alvorligt, at det er umuligt at påvise den reperfusionsskade, der følger. Derudover medfører længere iskæmiske tider risikoen for øget dødelighed. Som det ses i vores undersøgelse, døde 50% (3/6) af de oprindelige mus, der gennemgik 60 minutters iskæmi, efter kun 90 minutters reperfusion. Forkortelse af iskæmitiden til 45 min sænkede dødeligheden til 20% (1/5) uden at ændre vævsskadescorerne. Baseret på vores undersøgelse ser det ud til, at det ideelle vindue for iskæmisk skade kan opnås ved SMA-okklusion i ca. 45 minutter.

En anden variabel er reperfusionstiden før vævsindsamling. Som med iskæmitider varierer reperfusionstiderne meget på tværs af undersøgelser, fra 60 min til over 24 timer. Flere papirer har rapporteret, at tarmslimhinden pådrager sig maksimal morfologisk skade ved 2 til 3 timers reperfusion, med fuldstændig reparation opnået ved 24 timer 25,26,27. Opsamling af væv før dette vindue på 2 til 3 timer risikerer ikke at fange det fulde omfang af reperfusionsskaden, mens væv høstet tættere på 24 timer allerede har startet reparationsprocessen. Vi valgte oprindeligt en reperfusionstid på 120 min, men skiftede derefter til 90 min i et forsøg på at sænke dødeligheden. Denne ændring ændrede ikke resultaterne af vævsskade, hvilket tyder på, at en afvigelse på 30 minutter fra vinduet på 2 til 3 timer er acceptabel.

Iltkoncentration er også en vigtig variabel i udviklingen af IRI. Wilding et al. fandt, at sammenlignet med mus, der modtog 21%O2, oplevede de, der blev bedøvet med isofluran leveret med 100%O2 , ventilationsperfusionsmismatch på grund af atelektase. I samme undersøgelse udviklede rotter, der fik 100%O2 , akut respiratorisk acidose og forhøjet gennemsnitligt arterielt tryk28. Sådanne fysiologiske ændringer undgås bedst ved inducering af en skade som IRI, hvor en række systemiske faktorer er involveret. Således synes 21%O2 at være mere passende end 100%O2 som bæregas til levering af isofluran.

Anvendelsen af heparin i denne protokol er åben for debat. Heparin er kendt for at have antikoagulative og antiinflammatoriske virkninger29. Vi fandt, at skift fra 60 min iskæmi og 120 min reperfusion til 45 min iskæmi og 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin ikke ændrede mikroskopisk tarmskade, men gjorde lavere dødelighed. En mulig forklaring er, at heparin forhindrede dødelig tromboemboli i fjerne organer som lunger og hjerne, men vi fandt ikke tegn på dette ved obduktion ved grov eller mikroskopisk undersøgelse af de to første mus, der døde. Brug af kortere iskæmi og reperfusionstider uden heparin kan være lige så effektiv til at reducere dødeligheden. Hvis det var tilfældet, ville det være klogt at afstå fra brugen af heparin for at minimere interferens med IRI. Imidlertid kan inkludering af heparin i protokollen være hensigtsmæssigt for dem, der ønsker at modellere kirurgiske årsager til IRI, da kirurgiske patienter ofte modtager heparin perioperativt.

Isofluran har vist sig at have vævsbeskyttende virkning i tilfælde af tarmbetændelse og iskæmi, og dets anvendelse kan interferere med en klinisk relevant IRI model 30,31,32. Imidlertid er organofluorinhalanter (dvs. isofluran, sevofluran) almindeligt anvendte anæstetika i både veterinær- og humanmedicin. Derudover overstiger længden af anæstesi, der kræves til denne protokol, 120 minutter, og derfor er et inhalationsmiddel mere passende end et korterevirkende injicerbart, som skal doseres igen.

Ingen mikroskopiske læsioner var til stede i den proksimale tyktarm, lever eller nyre. Manglen på mikroskopiske ændringer skyldtes måske den relativt korte 90 til 120 minutters reperfusionstid. Derudover har den proksimale tyktarm en blodforsyning fra den ringere mesenteriske arterie. Mangel på synlige skader udelukker dog ikke systemisk skade. Revers transkriptionskvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er sandsynligvis en bedre metode til at demonstrere systemisk skade ved at måle inflammatoriske cytokiner såsom TNF-α.

Flere variationer af denne intestinale IRI-model er blevet udviklet gennem årene. I 1990 viste Megison et al., at udelukkelse af sikkerhedskar ud over SMA producerede en mere konsekvent reduktion af mesenterisk blodgennemstrømning, men en stigning i dødeligheden33. En nyere undersøgelse viste, at i stedet for at udelukke SMA ved basen, gav ligering af dets perifere og sideordnede grene for at fremkalde iskæmi i det distale ileum reproducerbar skade uden dødelighed34. Okklusion af de lokale arterielle grene sikrer maksimal iskæmi og kan løse problemet med multifokale, segmentale reduktioner af blodgennemstrømningen set med ligering af SMA lige ved dens base. Mens denne alternative metode til modellering af intestinal IRI har anvendelse til forskning i de lokale vævseffekter af intestinal IRI, er det ukendt, om det nøjagtigt kan modellere den systemiske inflammation og multiorgansvigt, som kan være forbundet med tarmskade.

SMA-okklusion er ikke en passende model for alle typer intestinal IRI. Ikke-okklusiv mesenterisk iskæmi er for eksempel karakteriseret ved splanchnisk hypoperfusion som følge af nedsat hjerteudgang. Derfor ville denne teknik ikke være optimal til at studere intestinal IRI forårsaget af myokardieinfarkt, kongestiv hjerteinsufficiens, aortainsufficiens eller nyre- eller leversygdom35. Kozar et al. rapporterede, at SMA-okklusion imidlertid er en klinisk relevant model for tarm-IRI induceret af shock36. Selvom det er mindre økonomisk, kan brugen af andre arter som svin have fordele i forhold til gnavere til modellering af visse tarmskadeforhold. En omfattende gennemgang af Gonzalez et al. i 2014 beskriver dyremodeller, der i øjeblikket er i brug til undersøgelse af intestinal IRI9.

På trods af dets begrænsninger forbliver teknikken til at okkludere SMA ved dens base en af de mest almindeligt anvendte gnavermodeller af intestinal iskæmi9. Da det kun kræver en vaskulær klemme og en grundlæggende opsætning, er selve operationen ganske enkel. Det giver også reproducerbar skade, som det fremgår af de data, der præsenteres her. SMA-okklusion hos gnavere kan pålideligt modellere okklusive årsager til intestinal IRI og kan have praktisk anvendelse i både veterinær- og humanmedicin. Derfor er det vigtigt, at de procedurer, vi har skitseret her, gennemføres konsekvent.

Disclosures

Forfatterne af denne artikel har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Finansiering til dette projekt blev leveret af Division of Intramural Research of the National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health.

Vi vil gerne takke Dr. James Hawkins for hans mentorskab og støtte. Vi takker også Dr. Mihai Oltean og Robert Linford for deres hjælp med at lokalisere den overlegne mesenteriske arterie. Vi vil gerne takke dr. Patricia Carvalho, Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini og George Howell III for at stille deres ekspertise til rådighed under udviklingen af denne protokol. Endelig vil vi gerne takke Stephen Wincovitch for hans hjælp med at erhverve de smukke fotomikrografier, der findes i dette papir og Dr. Alicia Olivier for hendes hjælp med at mærke og gengive de endelige tal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adson forceps Roboz RS-5236 Surgical instrument
Alm retractor Roboz RS-6510 Surgical instrument
Anesthesia machine Datex-Ohmeda Aestiva 5
Anesthesia: isoflurane Baxter Healthcare Corporation NDC 10019-360-40 Dose: 1-4%, INH
Angiocath 20 g  x 2 Smiths Medical 5057 Flushing intestines with saline and formalin
Atraumatic microvascular clip Teleflex 065100 Surgical instrument
Buffered formalin 10% Fisher Scientific 23-245684 Tissue fixation
Bupivicaine 0.25% Hospira, Inc. NDC 0409-1160-18 Dose: up to 2 mg/kg drop-wise
Buprenorphine Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 Dose: 1 mg/kg, SQ
Chlorhexidine scrub 2% Vet One 510083 Surgical site prep
Circulating water blanket Cincinnati Sub Zero Blanketrol 2 Body temp maintenance
Clippers - Wahl BravMini, Purple Hair clippers Lambert Vet Supply 008WA-41590-0438 Surgical site prep
Conical tubes 50 ml Fisher Scientific 14-432-22 Tissue fixation and storage
Dry ice N/A N/A PCR tissue samples
EtOH 200 proof The Warner-Graham Company 64-17-5 Tissue storage
Heparin (optional) Meitheal Pharmaceuticals NDC 71288-402-11 Dose: 200-600 IU/kg
Induction chamber VetEquip 941456
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor Indus Instruments N/A For monitoring rodent body temperature during surgery
Isopropyl Alcohol 70% Humco NDC 0395-4202-28 For scrubbing surgical site
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL Fisher Scientific 05-408-121 PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage
Microsoft Excel Microsoft N/A
Nose cone N/A N/A Can be homemade with syringe tube or bubble tubing
O2 medical air 21% Roberts Oxygen N/A Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume
Ophthalmic ointment Akorn, Inc. NDC 17478-062-35 Surgical prep
PBS pH 7.4 (1x) ThermoFisher Scientific 10010-031 For tissue rinsing and making 70% EtOH
Specimen cups Cardinal Healthcare C13005 For holding tissue cassettes in formalin
Sterile Castroviejo Needle Holder Roboz RS-6412 Surgical instrument
Sterile cotton swabs Medline BXTA50002Z
Sterile gauze Medline PRM21423Z
Sterile Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5980 Surgical instrument
Sterile micro dissecting spring scissors Roboz RS-5693 Surgical instrument
Sterile micro forceps Roboz RS-5264 Surgical instrument
Sterile saline (0.9%) Braun R5201-01 Must be warmed
Sterile scalpel blade #15 Cardinal Health (Allegiance) 32295-015 Surgical instrument
Sterile scalpel handle Roboz RS-9843 Surgical instrument
Sterile surgical drape Medline DYNJSD1092
Sterile surgical gloves Medline MSG2270
Sterile surgical stapler Roboz RS-9260 Surgical instrument
Sterile surgical staples Roboz RS-9262 Abdominal skin closure
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle Ethicon J212G Closing abdominal muscle
Surgical tape Medline MMM15271Z Securing mouse in dorsal recumbancy
Syringe 10 ml x 2 Medline SYR110010 Flushing intestines with saline and formalin
Tissue cassettes Fisher Scientific 22-038-665 Rolled intestinal segments. 4 per mouse.
Towel or drape Medline GEM2140 Water blanket cover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
  2. Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
  3. Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , University of Adelaide Press. 331-350 (2011).
  4. Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
  5. Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
  6. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
  7. McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
  8. Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  10. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
  11. García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
  12. Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
  13. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  14. Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023).
  15. Scudamore, C. L. A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , John Wiley and Sons. (2014).
  16. Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
  17. Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
  18. Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
  19. Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
  20. Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
  21. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  22. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Elsevier. (1965).
  23. Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
  24. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
  25. Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
  26. Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
  27. Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
  28. Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
  29. Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
  30. Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
  31. Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
  32. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
  33. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
  34. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
  35. Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
  36. Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).

Tags

Intestinal iskæmi-reperfusionsskade gnavermodel overlegen mesenterisk arterieokklusion gastrisk dilatationsvolvulus mesenterisk torsion kolik dannelse af frie radikaler iltgenindførelse dårlig prognose in vivo-model isofluranbedøvelse reproducerbar skade histopatologi tyndtarm tyktarm lever nyrer
Gnavermodel af intestinal iskæmi-reperfusionsskade via okklusion af den overlegne mesenteriske arterie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henein, L., Clevenger, R., Keeran,… More

Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery. J. Vis. Exp. (200), e64314, doi:10.3791/64314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter