我们开发了一种机械成像管道来研究异质结构和机械动脉粥样硬化斑块特性。该管道能够关联胶原纤维取向的局部优势角度和分散、破裂行为和纤维斑块组织的应变指纹。
冠状动脉和颈动脉动脉粥样硬化斑块破裂是致命心血管事件的主要原因。然而,异质性、高度胶原斑块组织的破裂机制,以及这与组织的纤维结构的关系,尚不清楚。现有的研究斑块力学的管道仅限于根据组织结构均匀性的假设获得斑块组织的粗体机械特性。然而,纤维斑块组织在结构上是异质的,可以说主要是由于胶原纤维结构的局部变化。
这里描述的机械成像管道已被开发用于研究异质结构和机械斑块特性。在该管道中,使用具有二次谐波(SHG)的多光子显微镜(MPM)表征组织的局部胶原蛋白结构,并使用数字图像相关(DIC)分析在单轴拉伸测试条件下表征组织的破坏行为。该实验管道能够关联胶原纤维取向的局部优势角度和分散、破裂行为和纤维斑块组织的应变指纹。所获得的知识是更好地理解、预测和预防动脉粥样硬化斑块破裂事件的关键。
缺血性卒中通常由颈动脉动脉粥样硬化斑块破裂引发,是全球死亡和发病的主要原因之一1。然而,目前预防颈动脉粥样硬化相关脑卒中的手术治疗计划策略不包括斑块破裂风险评估2。这主要是因为先前建议的风险生物标志物,例如斑块帽厚度3 和脂质核心大小4,已被证明对未来临床事件的预测价值不理想5,6。更好地了解斑块力学和破裂机制对于优化斑块破裂风险评估和识别动脉粥样硬化斑块的新风险标志物是必要的。
斑块破裂是一种局部机械事件,其中高度纤维斑块组织无法承受血压施加在其上的机械负荷并失去其结构完整性7。尽管如此,斑块破裂事件的机制及其与底层微观结构的联系知之甚少8。少数表征斑块组织破坏特征的实验研究9,10,11,12,13报告了毛额机械断裂特性(即极限拉伸破坏应变和强度),这是通过组织结构均匀性的假设得出的。 然而,纤维斑块组织在结构上是异质的,可以说主要是由于胶原纤维结构的局部变化14。此外,斑块组织机械失效特征与胶原蛋白结构之间的联系仅在Johnston等人最近的一项研究中进行了研究。作者在主要纤维取向方面显示出斑块间差异,并报告了主要具有圆周纤维取向的纤维斑帽样品的较高极限应力和较低的极限应变15。然而,该研究也仅限于粗大的机械和结构性能。
为了阐明有关局部胶原蛋白结构和纤维斑块组织的局部机械特性的基本信息,在当前的研究中,我们开发了一种机械成像管道。这种 离体 管道能够量化局部胶原纤维的方向和分散,以及局部破裂应变。该管道涉及使用SHG进行MPM成像,以对斑块组织中的胶原纤维进行成像,以及DIC和单轴拉伸测试,以量化组织的破裂特征。
多光子显微镜-二次谐波发生(MPM-SHG)已成为研究生物组织中胶原蛋白的流行技术16。与其他胶原成像技术相比,该技术具有许多优势,例如组织学17,扩散张量成像(DTI)14和小角光散射(SALS)15。首先,MPM-SHG成像是非破坏性的,这使得它非常适合与机械测试相结合18。其次,SHG信号对胶原蛋白具有特异性,因此无需对组织进行染色。由于激发波长长(近红外),穿透深度大于其他显微镜技术16。SHG成像实现的高分辨率(μm级)也允许单个光纤的可视化。这提供了许多可能性,例如胶原纤维数量的局部定量,胶原纤维取向和分布19。
数字图像相关(DIC)结合力学测试是一种广泛使用的获得生物组织局部力学性能的方法20。使用DIC,通过比较在机械测试期间获得的高速相机图像来跟踪施加在组织表面上的斑点的位移20。该图像后处理方法用于估计标本20 的全场表面应变,也可用于研究组织21的破裂行为。
目前的研究重点是开发一种机械成像管道,以研究纤维动脉粥样硬化斑块组织的局部胶原取向和分散、局部机械性能和破裂行为之间的相关性。本文描述的协议具有创新性,原因有几个。首先,这是首次应用数字图像相关来测量机械载荷下纤维斑块组织的局部变形。其次,该协议提供了必要的信息来分析局部变形模式与纤维斑块组织的局部胶原结构之间的关联。结果部分中提供的菌株数据和胶原蛋白数据都强调了局部评估的重要性,这些数据显示了组织的异质性。因此,建议使用能够进行局部评估的技术,例如本协议中使用的技术,用于纤维斑块特性的未来研究。
测试样品制备是该协议的关键步骤之一。颈动脉斑块主要是胶原组织;然而,它们可能包含钙化,被认为会影响整体斑块机械行为36,37。由于研究的重点是斑块的纤维组织成分,因此通过使用μCT成像38避免了测试样品中的钙化。如果 μCT 不可用,可以考虑其他成像技术(如 MRI 或 OCT39 )来检测斑块中的钙化区域。对于严重钙化或含有分散钙化的斑块,获得没有钙化且尺寸足够大且可用于机械测试的纤维组织测试样品可能是一项具有挑战性的任务。该协议中另一项具有挑战性的任务是为数字图像相关生成最佳斑点模式。最佳DIC需要50:5028 的黑白比和三到五个像素29 的斑点大小以确保适当的质量。未能满足这些要求可能会导致局部应变测量不准确。最后,如果组织的自然标志不清晰,将破裂位置映射到SHG图像可能具有挑战性。对于此类样本,在成像前对组织应用几种基准标记物将有所帮助。
当前协议中使用的MPM-SHG技术优于许多其他胶原蛋白成像技术,因为它是一种具有相对较大穿透深度的高分辨率和非破坏性技术。然而,MPM-SHG的穿透深度(<400μm)存在局限性,因为它不允许对测试样品的整个厚度进行成像,其范围在0.5至2毫米之间。在最近的一项弥散张量磁共振成像(DT-MRI)研究中,我们已经证明斑块组织较深部分的主要纤维取向可能与组织更浅表的管腔部分的主要纤维取向不同14。因此,有必要进一步研究厚纤维斑块组织样本较深部分的局部胶原结构及其与局部组织力学的关系。为此,可以利用偏振空间频域成像(pSFDI)。据报道,这种最近开发的光学成像技术有可能测量二尖瓣小叶中深达0.8毫米的纤维取向12。pSFDI还提供快速采集,这也有助于整个样品区域的可视化,而不是像当前协议那样仅选择瓷砖。当前协议的另一个限制是只能识别表面变形。在未来的研究中,可以将镜子辅助多视图DIC40 或数字体积相关(DVC)41 包含在该协议中,以获取有关体积,地下应变的其他信息。
当前的实验方案可以通过多种方式进一步扩展或修改,以获得有关斑块破裂力学及其与底层微观结构关系的其他信息。首先,目前的协议包括圆周方向的单轴拉伸测试。之所以选择这种类型的机械测试,是因为斑块在 体内主要经历圆周方向的拉伸拉伸。为了更全面的机械表征,该协议可以进一步扩展,以纳入纵向膨胀测试,双轴测试或单轴拉伸测试。其次,目前的协议只关注通过DIC获得局部菌株。然而,通过在协议中包括局部应力分析,可以获得斑块力学行为的更完整视图,但这需要表征局部刚度。尽管目前具有挑战性,但这可以通过计算技术来实现,例如逆有限元方法42,43 和虚场方法44。除了实验适应之外,还可以在当前协议中添加一些额外的后处理步骤。首先,不仅可以识别破裂位置,还可以通过获得的高速相机图像 识别 裂纹扩展路径。该传播路径可以与局部结构和机械参数相关联。其次,在所述方案中直观地识别破裂起始位置。之前对非生物组织的研究使用DIC应变测量中的不连续性来检测破裂45。在斑块组织上应用这种自动破裂检测可能会提高破裂检测的准确性。最后,与其他胶原成像技术相比,MPM-SHG的一大优势是它可视化单个胶原纤维。因此,通过该协议 获得 的数据也可用于研究其他局部胶原蛋白特征,例如胶原蛋白含量。
该协议可用于更好地了解纤维斑块组织的局部特征,该成分在体内斑块破裂中机械失效。需要这些信息来建立新的结构和功能成像标志物,以预测患者的斑块破裂。这些新标志物是必要的,因为先前建议的风险生物标志物已被证明对未来的临床事件具有次优的预测价值5,6。将来,OCT和ps-OCT可以识别和量化动脉系统中的纤维组织46,47,48。此外,菌株被认为是局部斑块组合物的替代标志物49。因此,体内应变测量49可能有助于识别患者的斑块稳定性。但是,应注意将获得的结果直接转化为体内斑块破裂。首先,纤维斑块组织在体内经历比本协议中使用的单向拉伸载荷更复杂的负荷。其次,动脉粥样硬化斑块是多组分结构;纤维斑块组织中的体内应力和应变分布可能受到其他斑块成分的存在和位置的影响,例如钙化37。
这种机械成像管道也可用于研究其他胶原组织。胶原蛋白的全球力学测试和结构成像已经广泛用于生物组织。然而,对失效前和失效特性以及胶原蛋白结构的局部评估对于异质纤维组织的准确力学表征至关重要。我们预计,这一新协议的结构将为几种生物组织的微观结构和力学之间的相互作用提供进一步的见解。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由NWO-Vidi赠款(18360)资助。
10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
Excel | Microsoft | Version 2208 | |
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
Heating bath | N/A | Custom made | |
High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
Image J | National Institute of Health | N/A | |
LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
Needles | Emerald | BDAM302986 | |
Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |