Eine Methode zur Untersuchung der Korrelation zwischen lokaler Kollagenstruktur und mechanischen Eigenschaften von atherosklerotischem Plaque-Fasergewebe

Summary

Wir haben eine Mechano-Imaging-Pipeline entwickelt, um die heterogenen strukturellen und mechanischen atherosklerotischen Plaqueeigenschaften zu untersuchen. Diese Pipeline ermöglicht die Korrelation des lokal vorherrschenden Winkels und der Dispersion der Kollagenfaserorientierung, des Bruchverhaltens und der Dehnungsfingerabdrücke des fibrösen Plaquegewebes.

Abstract

Der Bruch von atherosklerotischen Plaques in Koronararterien und Halsschlagadern ist die Hauptursache für tödliche kardiovaskuläre Ereignisse. Die Rupturmechanik des heterogenen, stark kollagenen Plaquegewebes und wie dies mit der fibrösen Struktur des Gewebes zusammenhängt, ist jedoch noch nicht bekannt. Bestehende Pipelines zur Untersuchung der Plaque-Mechanik beschränken sich darauf, nur grobe mechanische Eigenschaften des Plaquegewebes zu erhalten, basierend auf der Annahme der strukturellen Homogenität des Gewebes. Fibröses Plaquegewebe ist jedoch strukturell heterogen, was wohl hauptsächlich auf lokale Variationen in der Kollagenfaserarchitektur zurückzuführen ist.

Die hier beschriebene Mechano-Imaging-Pipeline wurde entwickelt, um die heterogenen strukturellen und mechanischen Plaque-Eigenschaften zu untersuchen. In dieser Pipeline wird die lokale Kollagenarchitektur des Gewebes mittels Multiphotonenmikroskopie (MPM) mit Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) charakterisiert, und das Versagensverhalten des Gewebes wird unter einachsigen Zugversuchsbedingungen mittels digitaler Bildkorrelationsanalyse (DIC) charakterisiert. Diese experimentelle Pipeline ermöglicht die Korrelation des lokal vorherrschenden Winkels und der Dispersion der Kollagenfaserorientierung, des Bruchverhaltens und der Dehnungsfingerabdrücke des fibrösen Plaquegewebes. Das gewonnene Wissen ist der Schlüssel, um atherosklerotische Plaquerupturereignisse besser zu verstehen, vorherzusagen und zu verhindern.

Introduction

Der ischämische Schlaganfall, der häufig durch eine atherosklerotische Plaqueruptur in den Halsschlagadern ausgelöst wird, ist eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität weltweit¹. Die aktuellen Strategien zur chirurgischen Behandlungsplanung zur Vorbeugung von Schlaganfällen im Zusammenhang mit Karotis-Atherosklerose beinhalten jedoch keine Risikobewertung für Plaquerupturen². Dies liegt vor allem daran, dass die zuvor vorgeschlagenen Risikobiomarker, wie die Dicke der Plaquekappe³ und die Größe des Lipidkerns⁴, nachweislich einen suboptimalen prädiktiven Wert für zukünftige klinische Ereignisse haben ^5,6. Ein besseres Verständnis der Plaquemechanik und der Rupturmechanismen ist notwendig, um die Risikobewertung von Plaquerupturen zu optimieren und neue Risikomarker für atherosklerotische Plaques zu identifizieren.

Eine Plaqueruptur ist ein lokales mechanisches Ereignis, bei dem das hochfaserige Plaquegewebe der mechanischen Belastung durch den Blutdruck nicht standhält und seine strukturelle Integrität verliert⁷. Trotzdem sind die Mechanik des Plaquerupturereignisses und seine Verbindung zur zugrunde liegenden Mikrostruktur nur unzureichend verstanden⁸. Die wenigen experimentellen Studien, die das Versagen des Plaquegewebes charakterisierten, berichteten 9,10,11,12,13 über grobe mechanische Brucheigenschaften (d.h. endgültige Zugversagensdehnung und -festigkeit), die unter der Annahme einer strukturellen Homogenität des Gewebes abgeleitet wurden. Das fibröse Plaquegewebe ist jedoch strukturell heterogen, was wohl hauptsächlich auf lokale Variationen in der Kollagenfaserarchitektur zurückzuführen^{ist 14}. Darüber hinaus wurde der Zusammenhang zwischen den mechanischen Versagenseigenschaften des Plaquegewebes und der Kollagenarchitektur erst in einer aktuellen Studie von Johnston et al. untersucht. Die Autoren zeigten einen Interplaque-Unterschied in der vorherrschenden Faserorientierung und berichteten über höhere Endspannungen und niedrigere Enddehnungen für fibröse Plaquekappenproben mit einer überwiegend umlaufenden Faserorientierung¹⁵. Die Studie beschränkte sich jedoch auch auf die groben mechanischen und strukturellen Eigenschaften.

Um die wesentlichen Informationen über die lokale Kollagenarchitektur und die lokalen mechanischen Eigenschaften des fibrösen Plaquegewebes zu beleuchten, haben wir in der aktuellen Studie eine Mechano-Imaging-Pipeline entwickelt. Diese Ex-vivo-Pipeline ermöglicht die Quantifizierung der lokalen Richtung und Dispersion der Kollagenfasern sowie der lokalen Bruchdehnung. Die Pipeline umfasst MPM-Bildgebung mit SHG zur Abbildung von Kollagenfasern im Plaquegewebe sowie DIC- und einachsige Zugversuche zur Quantifizierung der Ruptureigenschaften des Gewebes.

Die Multiphotonenmikroskopie-Erzeugung der zweiten Harmonischen (MPM-SHG) hat sich zu einer beliebten Technik zur Untersuchung von Kollagen in biologischen Geweben entwickelt¹⁶. Die Technik hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen kollagenbildenden Verfahren, wie z. B. Histologie¹⁷, Diffusionstensor-Bildgebung (DTI)14 und Kleinwinkel-Lichtstreuung (SALS)¹⁵. Erstens ist die MPM-SHG-Bildgebung zerstörungsfrei, was sie ideal für die Kombination mit mechanischen Tests¹⁸ macht. Zweitens ist das SHG-Signal spezifisch für Kollagen, so dass keine Färbung des Gewebes erforderlich ist. Aufgrund der langen Anregungswellenlängen (Nahinfrarot) ist die Eindringtiefe größer als bei anderen Mikroskopietechniken¹⁶. Die hohe Auflösung (μm-Ebene), die mit der SHG-Bildgebung erreicht wird, ermöglicht auch die Visualisierung einzelner Fasern. Dies bietet viele Möglichkeiten, wie z.B. die lokale Quantifizierung der Anzahl der Kollagenfasern, der Orientierung und Verteilung der Kollagenfasern¹⁹.

Die digitale Bildkorrelation (DIC) in Kombination mit mechanischen Tests ist eine weit verbreitete Methode, um lokale mechanische Eigenschaften biologischer Gewebe zu erhalten²⁰. Mit DIC wird die Verschiebung von Speckles, die auf die Gewebeoberfläche aufgetragen werden, durch den Vergleich von Hochgeschwindigkeitskamerabildern verfolgt, die während der mechanischen Prüfung aufgenommen wurden²⁰. Dieses Bildnachbearbeitungsverfahren wird zur Abschätzung der Vollfeld-Oberflächendehnungen der Probe²⁰ verwendet und kann auch zur Untersuchung des Bruchverhaltens des Gewebes²¹ verwendet werden.

Protocol

Alle in diesem Papier beschriebenen Methoden wurden vom Ethical Research Committee am Erasmus Medical Center in Rotterdam genehmigt. Die Einverständniserklärung der Patienten wurde vor der Entnahme der Plaqueprobe eingeholt. Ein Workflow-Diagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Gewebeentnahme, Mikro-Computertomographie (μCT) und Probenvorbereitung Gewebeentnahme und -lagerungSammeln Sie frische atherosklerotische Plaque-Proben der menschlichen Halsschlagader von einwilligenden Patienten, die sich einer Carotis-Endarteriektomie unterzogen haben.HINWEIS: Die bei dieser Operation gewonnenen Plaqueproben bestehen aus der erkrankten Intimaschicht der Halsschlagader, einschließlich der Ansammlung von Fett (dem Lipidpool) und Verkalkungen22. Entfernen Sie Blutreste mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) und trocknen Sie die Probe mit einem Mullkissen ab. Legen Sie die Probe mit einer Pinzette in ein 15-ml-Röhrchen. Schockfrieren Sie das Gewebe ein, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang in flüssigen Stickstoff legen. Bewahren Sie die Probe nach dem Schockgefrieren bis zum Tag der μCT-Bildgebung in einem Gefrierschrank von -80 °C auf.HINWEIS: Das Schnappgefrieren minimiert die Kristallbildung, was zu mikrostrukturellen Schäden im Gewebe führt. Eine frühere Studie an Schweineaortengewebe hat gezeigt, dass das Schnappgefrieren und die Lagerung bei -80 °C keinen signifikanten Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Gewebes hatten23. μCT-BildgebungAm Tag der μCT-Bildgebung entnehmen Sie die Plaqueprobe aus dem 15-ml-Röhrchen. Wenn das Gewebe am Röhrchen klebt, füllen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur mit PBS. Lassen Sie das Gewebe in PBS, bis die Probe aus dem Röhrchen entnommen werden kann. Trocknen Sie die Plakette gründlich mit Seidenpapier ab. Schalten Sie das μCT-System ein, indem Sie die grüne Taste drücken. Drücken Sie in der CT-Software am unteren Bildschirmrand auf Aufwärmen und warten Sie 15 Minuten. Setzen Sie manuell einen Röntgenfilter von Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm in das μCT-System ein. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Wählen Sie die Parameter im linken Bereich aus. Wählen Sie in den Dropdown-Listen eine Scanzeit von 4 min, eine Auflösung von 172 μm, eine Spannung von 90 kV, eine Stromstärke von 88 mA, ein Sichtfeld von 86 mm und eine Drehung von 360°. Öffnen Sie die Tür des Geräts. Ziehen Sie die Plattform manuell heraus. Legen Sie den Parafilm auf die Plattform und legen Sie die Probe auf die Plattform (zum äußersten Ende der Plattform). Setzen Sie die Plattform manuell in das Gerät ein und schließen Sie die Tür. Aktivieren Sie den Live-Modus (Augensymbol ). Bewegen Sie die Plattform mit den Pfeilen im Gerät, um die Probe im Sichtfeld zu zentrieren. Starten Sie die Bildbearbeitung (Symbol unten in der Mitte). Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, drücken Sie auf das Türsymbol unten ( unter der Abbruchtaste). Nach dem μCT-Scan frieren Sie die Plaqueprobe erneut ein, wie in Schritt 1.1.3 beschrieben. Lagern Sie es bei -80 °C bis zum Tag der Multiphotonenmikroskopie-Bildgebung und mechanischen Tests. Öffnen Sie die erfassten DICOM-Dateien der μCT-Bildgebung in der Open-Source-3D-Slicer-Software24. Gehen Sie zum Segment-Editor . Wählen Sie Neue Segmentierung erstellen | das Volume, das als Master-Volume analysiert werden soll. Klicken Sie auf Hinzufügen , um ein Segment hinzuzufügen. Drücken Sie auf den Namen und die Farbe , um diese Parameter zu ändern. Um die Segmente zu definieren, klicken Sie im unteren Teil des Fensters auf Effekte | Schwellenwert. Verwenden Sie dieses Schwellenwertwerkzeug, um zwischen verkalkten (>450 HU) und nicht verkalkten (<450 HU) Geweberegionen zu unterscheiden. Sobald der Schwellenwert ausgewählt ist, drücken Sie im unteren Teil auf Übernehmen. Klicken Sie auf 3D anzeigen (rechts neben Hinzufügen), um die Segmentierung in der 3D-Ansicht zu visualisieren. Wenn es Bereiche der Segmentierung gibt, die nicht erwünscht sind, entfernen Sie diese mit dem Schereneffekt. Ändern Sie die Deckkraft von Segmenten im Segmentierungsmodul , indem Sie auf den Namen der gewünschten Segmentierung klicken.HINWEIS: Wenn möglich, kann die μCT-Bildgebung und die Überprüfung der μCT-Bilder am selben Tag wie der Rest des Protokolls durchgeführt werden. Überspringen Sie in diesem Fall Schritt 1.2.12. Beachten Sie jedoch, dass die nachfolgenden Schritte dieses Protokolls ebenfalls zeitaufwändig sind und am selben Tag durchgeführt werden sollten. Nach etwas Übung und mit den beschriebenen Einstellungen und Geweben sollte die μCT-Bildgebung ~ 45 Minuten dauern, die Überprüfung der μCT-Bilder ~ 15 Minuten, die Testprobenvorbereitung einer einzelnen Testprobe ~ 1 h, die Mikroskopie ~ 4 h und die einachsige Zugprüfung ~ 2 h. Vorbereitung von PrüfmusternTauen Sie die Plaque am Tag der Kollagenbildgebung und der mechanischen Untersuchung durch Eintauchen in PBS bei Raumtemperatur für ca. 10 Minuten auf. Öffnen Sie die 3D-Konstruktion der in den Schritten 1.2.13-1.2.18 erstellten Plakette in der 3D-Slicer-Software. Verwenden Sie die natürlichen Landmarken des Plaquegewebes, um zu identifizieren, welche Teile der 3D-Rekonstruktion der realen Plaqueprobe entsprechen. Identifizieren Sie, welcher Bereich der 3D-Rekonstruktion keine Verkalkungen enthält, und identifizieren Sie diesen Bereich visuell in der echten Plakette. Schneiden Sie die Plaque entlang der Längsachse der Arterie mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette auf. Wenn bereits ein Schnitt von der Operation vorhanden ist, beginnen Sie mit diesem Schnitt, um das Gewebe optimal zu nutzen. Wenn die Probe keine röhrenförmige Form hat und es schwierig ist, die Längsrichtung zu definieren, schließen Sie die Probe von der Prüfung aus. Schneiden Sie rechteckige Testproben aus den Plaque-Proben aus. Stellen Sie sicher, dass die Testproben so groß wie möglich sind, und vermeiden Sie Geweberegionen, die Risse oder Verkalkungen enthalten. Seien Sie beim Schneiden vorsichtig, da ein kleiner Riss oder Riss am Rand des Probekörpers während des Zugversuchs zu einer Rissausbreitung aus dem vorhandenen Riss führen kann. Stellen Sie sicher, dass die Prüflinge nach der Montage im Zugprüfgerät ein Verhältnis von Breite zu Länge (WL) von <1 in der Messlänge aufweisen. Erfüllen die Proben diese Anforderung, eignen sie sich für entsprechende Zugversuche im Hinblick auf Randbedingungen25.Hinweis: Der Bereich in den Stichprobenabmessungen kann groß sein. Die von den Autoren getesteten Proben hatten eine Messlänge zwischen 3,4 und 12,9 mm und eine Breite zwischen 1,6 und 6,4 mm. 2. Multiphotonenmikroskopische Bildgebung VorbereitungenVor dem Tag der Kollagenbildgebung und der mechanischen Prüfung verteilen Sie 40 g einer Silikonelastomerbasis auf zwei 50-ml-Röhrchen und geben Sie 2 g des Härtungsmittels (Verhältnis 1:10) mit einer Pasteurpipette in jedes Röhrchen (Verhältnis 1:10). Mischen Sie die beiden Komponenten mit der Pipette. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 1 Minute lang bei 700 × g , um so viele Luftblasen wie möglich zu entfernen. Eine Petrischale (10 cm Durchmesser) mit einer dünnen Schicht (ca. 0,5-1 cm) Silikon füllen und entweder 3 h bei 65 °C im Ofen inkubieren oder 48 h bei Raumtemperatur ausbrüten. Nehmen Sie eine Plaque-Testprobe und befestigen Sie beide Enden am Silizium, indem Sie Nadeln in das Gewebe stecken (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass die luminale Seite der Probe nach oben zeigt. Führen Sie die Nadeln in den Bereich der Probe ein, der sich während der mechanischen Prüfung in den Klemmen des Zugprüfgeräts befindet. Setzen Sie eine Schutzbrille auf. Verwenden Sie einen Seitenschneider, um die Nadeln so zu kürzen, dass sie weniger als ein paar Millimeter über die Probenoberfläche hinausragen, um zu verhindern, dass sie das Mikroskopobjektiv beschädigen. Füllen Sie die Petrischale mit PBS, bis die Probe untergetaucht ist. Aufbau der MikroskopieStellen Sie sicher, dass ein geeignetes Objektiv auf dem Multiphotonenmikroskop montiert ist. Verwenden Sie ein Objektiv, das für die Übertragung von Infrarotlicht optimiert ist, mit einer 20-fachen Vergrößerung. Starten Sie das Mikroskopsystem. Öffnen Sie die Bediensoftware des Mikroskops. Wenn Sie aufgefordert werden, den Bildgebungstisch zu initialisieren, stellen Sie sicher, dass der Kondensorarm des Mikroskops zurückgeschoben ist und sich das Objektiv in der niedrigsten Position befindet. Aktivieren Sie den Multiphotonenlaser. Stellen Sie die Petrischale mit der Testprobe unter das Objektiv, wie in Abbildung 3 dargestellt. Achten Sie darauf, das Objektiv noch nicht über der Probe zu platzieren, da die Lasereinstellungen noch optimiert werden müssen. Andernfalls kann es durch die mögliche hohe Leistung des Laserlichts zu einer Schädigung des Gewebes kommen. Stellen Sie sicher, dass das Ziel leicht in PBS eingetaucht ist. Verwenden Sie eine Pipette, um bei Bedarf zusätzliche PBS hinzuzufügen. Stellen Sie die Lichtwellenlänge auf 880 nm ein.HINWEIS: Diese Wellenlänge wird gewählt, da der SHG-Emissionsfilter im verwendeten Zwei-Photonen-System eine Mittenwellenlänge von ca. 440 nm hat. Für andere Mikroskope könnte eine andere Wellenlänge besser geeignet sein. Kachelscan und Auswahl der BildgebungsorteSchalten Sie den Multiphotonenlaser aus und aktivieren Sie den Hellfeldmodus des Mikroskops. Schalten Sie dann den Live-Scan-Modus ein. Positionieren Sie den Tisch so, dass sich das Objektiv über der Probe befindet, und stellen Sie die Probenoberfläche scharf. Deaktivieren Sie den Live-Scan-Modus . Ändern Sie auf der Registerkarte ” Erfassung” im zweiten Bereich den Zoomfaktor auf 1 , indem Sie die gewünschte Leiste verschieben.HINWEIS: Dieser Zoomfaktor bestimmt zusammen mit dem Vergrößerungsfaktor des Objektivs (20x) die Größe des aufgenommenen Bildes (739 μm x 739 μm). Ändern Sie auf der Registerkarte ” Aufnahme” im zweiten Bereich die Scangeschwindigkeit auf 400 Hz, den Zeilendurchschnitt auf 1 und die Auflösung auf 128 x 128 Pixel pro Bild (Pixelgröße ~5,8 μm x 5,8 μm) mithilfe der Dropdown-Listen. Klicken Sie auf der Registerkarte ” Erfassung” im ersten Bereich auf das Rastermustersymbol und warten Sie, bis ein Kachelscanfeld angezeigt wird. Schalten Sie den Live-Scan-Modus ein. Bewegen Sie das Objektiv mit den Knöpfen auf dem Smart-Panel in eine Ecke der Probe und klicken Sie auf das Markierungspositionssymbol im Kachel-Scan-Panel. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Ecke der Probe. Bei korrekter Ausführung wird ein Raster mit allen ausgewählten Kacheln für die Bildgebung in Orange angezeigt. Schalten Sie die Auto-Stitching-Funktion aus. Klicken Sie in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf Start , um einen Kachelscan der gesamten Probenoberfläche zu erstellen, um einen Überblick über die Probengeometrie zu erhalten.HINWEIS: Basierend auf den beschriebenen Einstellungen, dem Gewebe und dem Mikroskopsystem dauert die Erfassung eines Kachelscans der gesamten Probenoberfläche ~10 Minuten. Beobachten Sie nach dem Kachelscan die x- und y-Koordinaten der oberen linken Ecke jeder Kachel im Kachelscan-Panel, die automatisch von der Software des Mikroskopiesystems angezeigt werden. Notieren Sie sich diese Koordinaten in einer Tabelle. Beobachten Sie in der Mikroskopsoftware im Kachel-Scan-Panel die Anzahl der Kacheln in x- und y-Richtung in dem Feld Scanfield. Notieren Sie sich die Größe des Kachelscans in der Tabelle. Berechnen Sie die Koordinaten der anderen Kacheln, indem Sie die Größe der Kachel (739 μm) addieren/subtrahieren.HINWEIS: Diese Koordinaten sind notwendig, um die genaue Position der Kacheln zu identifizieren, die mit SHG-Bildgebung gescannt werden sollen. Wenn die Gesamtbildzeit keine Rolle spielt, können alle Kacheln abgebildet werden, ohne dass eine Kachel übersprungen werden muss. Wählen Sie aus dem Kachelscan die Kacheln aus, die mit SHG-Bildgebung abgebildet werden sollen. Vermeiden Sie bei dieser Auswahl Kacheln, die sich in den Klemmen befinden, und lassen Sie eine Kachel zwischen jeder ausgewählten Kachel sowohl in Längs- als auch in Umfangsrichtung, wie in Abbildung 2B gezeigt. Kollagen visualisieren: SHG-BildgebungSchalten Sie das Licht im Raum aus und decken Sie den Mikroskoptisch mit Verdunkelungsgewebe ab, damit kein Licht aus dem Raum den Detektor erreicht.HINWEIS: Durch die Minimierung des Lichts, das die Detektoren erreicht, wird das Rauschen während der Bildaufnahme verringert. Schalten Sie den Multiphotonenlaser (MP) ein. Wählen Sie den NDD-Detektor (Non-Descanned Detection), der mit einem Bandpassfilter von 430 bis 450 nm ausgestattet ist. Identifizieren Sie die Position der Kacheln, die abgebildet werden sollen, anhand der in Schritt 2.3.10 erfassten Informationen. Geben Sie die Koordinaten in die dafür vorgesehenen Felder ein und drücken Sie die Eingabetaste, damit sich das Ziel auf die rechte Kachel bewegt. Schalten Sie den Live-Scan-Modus ein.HINWEIS: Mit anderen Mikroskopen oder neueren Versionen der Betriebssoftware kann das Verschieben an Positionen innerhalb des Kachelscans automatisch erfolgen. In diesem Fall ist es nicht notwendig, die x- und y-Koordinaten jeder Kachel zu notieren (Schritt 2.3.10) und die Koordinaten in die Bediensoftware einzugeben (Schritt 2.4.4). Erhöhen Sie die MP-Laserleistung, indem Sie den Schieberegler im oberen Bereich unter den Strahlengangseinstellungen verwenden, um die höchstmögliche Laserleistung ohne nennenswertes Ausbleichen zu erhalten. Passen Sie dann die Verstärkung des Detektors an, um helle Bilder zu erhalten, jedoch ohne gesättigte Pixel, indem Sie den Knopf auf dem Smart Panel verwenden oder auf den Namen des Detektors unter Strahlengangseinstellungen | Zusätzliche Kanäle klicken. Typische Werte für die Detektorverstärkung liegen zwischen 500 und 800 V. Verwenden Sie den Z-Positionsknopf auf dem Smart Panel , um die Fokusebene einzustellen. Bewegen Sie sich an den Anfang der Probe und legen Sie die Positionen der Oberseite des Z-Stapels fest, indem Sie auf die Pfeilspitze im Z-Stapel-Bedienfeld klicken (unter der Registerkarte “Erfassung” | 3. Bedienfeld). Konzentrieren Sie sich dann auf die Probe, bis das SHG-Signal nicht mehr erkannt wird – dies ist das Ende des Stapels. Klicken Sie erneut auf die Pfeilspitze im Z-Stack-Bedienfeld, um diese Position festzulegen. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den Live-Scan-Modus aus.HINWEIS: Das Gewebe ist möglicherweise nicht ganz flach. Daher kann die Probenoberfläche verschiedener Regionen innerhalb des Gewebes leicht unterschiedliche Positionen in z-Richtung aufweisen. Halten Sie auf der Registerkarte ” Aufnahme” im zweiten Bereich die Scangeschwindigkeit bei 400 Hz, stellen Sie den Zeilendurchschnitt auf 2 und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel pro Bild (Pixelgröße von ~1,4 μm x 1,4 μm) ein, indem Sie die Dropdown-Listen verwenden. Schalten Sie die bidirektionale X-Scan-Taste ein. Klicken Sie im Z-Stapel-Panel auf Z-Schrittgröße und füllen Sie eine Z-Schrittgröße von 3 μm in das Feld ein. Klicken Sie in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf Start, um einen Z-Stapel zu erstellen. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie sicher, dass Sie die Koordinaten der Kachel im Dateinamen speichern oder jeder Kachel eine eigene Nummer geben (wie in Abbildung 2B).HINWEIS: Basierend auf den beschriebenen Einstellungen, dem Gewebe und dem Mikroskopsystem dauert die Erfassung eines Z-Stapels einer einzelnen Kachel ~10-15 Minuten. Die Vorbereitungsschritte (Schritte 2.4.4-2.4.10) sind in dieser Zeitschätzung enthalten. 3. Mechanische Prüfung Vorbereitung des einachsigen ZugversuchsaufbausMachen Sie den horizontalen Zugversuchsaufbau (Abbildung 4) einsatzbereit und befolgen Sie die Anweisungen für den Zugprüfer (z. B. Software einschalten, Klemmen anbringen, Wägezelle anbringen). Um das Verrutschen der Testprobe zu minimieren, befestigen Sie beidseitiges Schaumstoffband (Abbildung 4A, B-2) an den Innenseiten der Klemmen des Zugprüfgeräts und Schleifpapier an der Innenseite des Schaumstoffbandes. Schließlich kommt das Schleifpapier mit der Testprobe in Kontakt. Stellen Sie das Heizbad (Abbildung 4A, B-3) in Position. Füllen Sie das Heizbad mit PBS bis zur Unterseite der Klemmen, damit es das Schleifpapier noch nicht erreicht. Schalten Sie die Stromquelle des Heizbades ein und stellen Sie die Temperatur auf ca. 37 °C ein. Montieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera über dem Zugprüfsystem (Abbildung 4A-4), z. B. mit einem Laborstativ, und montieren Sie ein Objektiv mit einer Brennweite von 50 mm über einen Zwischenring an der Kamera. Stellen Sie sicher, dass die Klemmen scharf sind und dass das Sichtfeld groß genug ist, um die Probe während des gesamten Dehnungsvorgangs aufzunehmen (FOVBREITE: ± die Probenbreite; FOV-Länge: ± 2-fache Probenlänge). Montieren Sie das Beleuchtungssystem (Bild 4A-5) über dem Zugprüfsystem, z. B. mit einem Laborstativ. Schalten Sie das Beleuchtungssystem ein und stellen Sie die Lichtintensität und -position so ein, dass auf dem Kamerabild keine Reflexionen auf der PBS-Oberfläche zu beobachten sind. Passen Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung der Kamera an, um klare Bilder zu erhalten. Stellen Sie die Bilderfassungssoftware so ein, dass sie mit 30 Bildern/s bei einer Auflösung von 5,2 MP aufnimmt.HINWEIS: Diese hohe Bildrate wird benötigt, um die anschließende DIC-Analyse durchzuführen und das Bruchverhalten zu untersuchen. Stellen Sie die Verdrängungsgeschwindigkeit einer der Klemmen so ein, dass die globale technische Dehnungsrate während der mechanischen Prüfung der physiologischen In-vivo-Dehnungsrate des Gewebes ähnlich ist(5%/s für Plaquegewebe26). Erzeugung von Speckle-MusternHINWEIS: Dieses Speckle-Musterprotokoll basiert auf früheren Arbeiten von Walsh et al.27.Trocknen Sie die Probe, indem Sie sie leicht mit Seidenpapier abtupfen. Geben Sie den schwarzen Gewebefarbstoff in den dafür vorgesehenen Eimer der Airbrush. Schließen Sie die Airbrush an den Kompressor an. Schalten Sie den Airbrush-Kompressor ein und stellen Sie den Druck auf 25 PSI ein. Versuchen Sie, ein optimales Speckle-Muster auf Papier zu erstellen, bevor Sie es auf das Taschentuch sprühen. Sprühen Sie einige Male, bis ein Schwarz-Weiß-Verhältnis von 50 :5028 erreicht ist. Bewegen Sie die Nadel der Airbrush hin und her, um die Rauheit des Speckle-Musters anzupassen, bis die Größe eines Speckles der Größe von 3-5 Pixeln der Hochgeschwindigkeitskamera29 entspricht.HINWEIS: Das Speckle-Muster wird für zwei verschiedene Zwecke verwendet. Zunächst wird die Verschiebung dieser Speckles gemessen, indem Hochgeschwindigkeitskamerabilder verglichen werden, die während der mechanischen Prüfung aufgenommen wurden (DIC, Schritt 4.2). Zweitens wird dieses Speckle-Muster verwendet, um die Bruchstelle auf dem Bild des unverformten Zustands der Probe zu identifizieren (Schritt 4.3.1). Halten Sie die Airbrush ca. 30 cm vom Testmuster entfernt und sprühen Sie auf die Leuchtfläche. Lassen Sie den Farbstoff 1 Minute lang bei Raumtemperatur an die Probe binden, bevor Sie die Probe in PBS tauchen. Einachsiger ZugversuchLegen Sie die Probe in die Klemmen des Zugprüfgeräts, wobei die Umfangsrichtung der Proben mit der Zugstreckrichtung ausgerichtet ist und die luminale Seite der Probe nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass die anfängliche Messlänge so eingestellt ist, dass das WL-Verhältnis der Streifen <1 beträgt. Ziehen Sie die Schrauben der Griffe fest, indem Sie mit einem Drehmomentschraubendreher ein Drehmoment von 20 cNm aufbringen. Tun Sie dies schrittweise, indem Sie ein kleines Drehmoment auf jede Schraube ausüben, bevor Sie das endgültige Drehmoment aufbringen. Überprüfen Sie visuell, ob die Probe Risse enthält, die die Tests beeinflussen könnten. Geben Sie mehr PBS in das Heizbad, bis die Probe untergetaucht ist, und warten Sie, bis die Temperatur des PBS wieder 37 °C erreicht hat. Erfassen Sie mit der Hochgeschwindigkeitskamera ein Kalibrierbild, in dem der Prüfling und ein Lineal als Referenz enthalten sind. Stellen Sie sicher, dass sich das Lineal im gleichen Abstand vom Kameraobjektiv befindet wie die luminale Oberfläche der Probe. Tarieren Sie die Wägezelle und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der globalen Kraft- und Wegmessungen von der Wägezelle und dem Aktuator des Zugprüfgeräts. Begradigen Sie die Probe, indem Sie eine Vordehnung von 0,05 N auftragen, um den Durchhang in der Probe zu beseitigen. Führen Sie 10 Vorkonditionierungszyklen mit einer Dehnung von bis zu 10 % durch, basierend auf der Messlängenmessung durch den Aktuator nach dem Auftragen der Vordehnung. Starten Sie den einachsigen Zugversuch bis zum vollständigen Versagen der Probe, während Sie mit der Hochgeschwindigkeitskamera ein Video der Probenverformung aufnehmen. Beenden Sie nach dem Versagen des Gewebes die Aufzeichnung der globalen Kraft- und Verschiebungsmessungen.HINWEIS: Einige handelsübliche Zugprüfgeräte können die Schritte 3.3.6-3.3.9 automatisch ausführen. Das aktuelle Protokoll beschreibt die manuellen Schritte, die zu unternehmen sind, wenn diese automatische Option nicht in dem verwendeten Zugprüfgerät enthalten ist. Nehmen Sie die Probe aus dem Zugprüfgerät und entsorgen Sie sie entsprechend. Ersetzen Sie beim Testen der nächsten Probe das Schleifpapier und das Schaumstoffband an den Klemmen. 4. Datenanalyse Analyse der Kollagen-OrganisationÖffnen Sie die Z-Stapel, die während der MPM mit SHG in ImageJ erhalten wurden, und erstellen Sie Projektionen mit maximaler Intensität (MIPs) für jeden Z-Stapel. Analysieren Sie jeden MIP mit dem Open-Source-MATLAB-basierten FOA-Tool (Fiber Orientation Analysis)30, um den Orientierungswinkel der einzelnen Kollagenfasern in den Kacheln zu messen. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Skalen: [3 4 5] oder [2 4 6], abhängig vom Gefäßdurchmesser, und Behälterschwelle: 0,999, 0,9995 oder 0,9999, abhängig von der Intensität des SHG-Signals.HINWEIS: Weitere Informationen zur Verwendung dieses Tools finden Sie im Handbuch31 der Software. Verwenden Sie ein weiteres Open-Source-MATLAB-basiertes Tool, FibLab32, um eine Gaußsche Verteilung an das Winkelverteilungshistogramm anzupassen.HINWEIS: Weitere Informationen zur Verwendung dieses Tools finden Sie im Handbuch32 der Software. Extrahieren Sie aus dem Gaußschen Verteilungsdiagramm, das mit FibLab erhalten wurde, die folgenden Strukturparameter aus dem Arbeitsbereich von MATLAB: den vorherrschenden Faserwinkel (μ p), der die Art der Verteilung ist, die Standardabweichung (σp) der Faserwinkelverteilung und den anisotropen Anteil (Pani = 1 − Piso).ANMERKUNG: Der isotrope Anteil ist die Fläche unter der Basislinie in der Gaußschen Verteilung, während die anisotrope Fraktion die Fläche des Peaks über dieser Basislinie33 enthält. Sowohl σp als auch Pani geben Aufschluss über die Dispersion der Faserorientierung im Fliesenbereich. Zeichnen Sie zur visuellen Inspektion μp mithilfe von orientierten Linien und σp und Panimithilfe von Farbkarten. Digitale Bildanalyse und BruchanalyseFühren Sie eine visuelle Inspektion der Kamerabilder durch, um den Rahmen zu identifizieren, in dem die Bruchinitiierung auftritt. Identifizieren Sie in diesem Rahmen visuell die Bruchstelle. Führen Sie zu Beginn der mechanischen Prüfung eine Sichtprüfung der Kamerabilder durch, um eventuelle Risse oder Risse an der Bruchstelle zu erkennen. Wenn ein solcher Riss vorhanden ist, schließen Sie die Probe von der Analyse aus. Führen Sie die DIC-Analyse mit der MATLAB-basierten Open-Source-Software Ncorr (v1.2)34 durch. Befolgen Sie die Schritte im Ncorr-Handbuch35.Verwenden Sie die Kamerabilder, die während des Zugversuchs aufgenommen wurden, mit der Hochgeschwindigkeitskamera für DIC. Wählen Sie als Referenzbild das letzte Bild vor der endgültigen Dehnung bis zum Versagen (nach der Vorkonditionierung) aus. Wählen Sie für die aktuellen Bilder alle Bilder vom Beginn der letzten Dehnung bis zum letzten Bild vor dem Bild aus, in dem die Bruchinitiierung aufgetreten ist. Wählen Sie die Probenoberfläche als Region of Interest (ROI) aus. Schließen Sie die Bereiche aus, die sich in der Nähe (ca. 1 mm) der Klemmen befinden, da die Dehnungen in diesen Bereichen stark von den Griffen beeinflusst werden. Führen Sie eine DIC-Analyse mit den folgenden Parametern durch: Teilmengenradius: 30 Pixel; Teilmengenabstand: drei Pixel; Iterations-Cutoff: 50; Norm des Differenzvektor-Cutoffs: 10-5; Dehnungsradius: 5; Automatische Ausbreitung, Schritt #: 5. Aus der DIC-Analyse mit Ncorr erhalten Sie die Green-Lagrange-Verteilungen (oder Eulersche Stammverteilungen) des ROI. Verwenden Sie diese Dehnungsverteilungen, um die durchschnittliche Green-Lagrange-Dehnung der gesamten Plaque-Probenoberfläche im letzten Rahmen vor dem Bruch zu berechnen. Berechnen Sie die Green-Lagrange-Dehnung an der Bruchstelle. Korrelation von strukturellen und mechanischen Daten an der BruchstelleIdentifizieren Sie anhand der natürlichen Landmarken in der Testprobe und der auf der Testprobe angebrachten Sprenkel die Bruchstelle (identifiziert in Schritt 4.2.1) auf dem Referenzbild (Schritt 4.2.3.1). Erstellen Sie unter Verwendung der natürlichen Orientierungspunkte im Testbeispiel eine Überlagerung des Referenzbilds und des Kachelscans (Schritt 2.3), um die Bruchstelle auf dem Kachelscan zu identifizieren. Identifizieren Sie die MPM-SHG-Kachel, an der der Bruch aufgetreten ist. Wenn sich der Bruch nicht in einer Kachel befindet, die mit dem MPM-SHG gescannt wurde, identifizieren Sie die Kachel, die der Bruchstelle am nächsten liegt. Ermitteln Sie die Strukturparameter, die an der Kachel gefunden wurden, an der der Bruch aufgetreten ist.

Representative Results

Gewebeentnahme und ProbenvorbereitungDie Gewebeentnahme liefert Plaque-Fasergewebeproben, die für die strukturelle Bildgebung und den einachsigen Zugversuch in einzelne Testproben zerlegt werden können. Idealerweise enthält eine entnommene fibröse Gewebeprobe Bereiche mit wenig bis gar keinen Rissen (Abbildung 5A) und Makroverkalkungen (Abbildung 5B). Ein Überschuss dieser Risse und Verkalkungen (Abbildung 5C) kann zu Plaqueproben führen, die die zuvor erwähnten Anforderungen an die Probengröße von WL 1 nicht erfüllen. Multiphotonenmikroskopische BildgebungDie SHG-Bildgebung und Bildnachbearbeitung liefert MIPs von jeder abgebildeten Kachel (Abbildung 6A, B). Die weitere Nachbearbeitung durch Faserdetektion (Abbildung 6C) liefert Faserorientierungshistogramme (Abbildung 6D), aus denen Kollagenstrukturparameter extrahiert werden können (Abbildung 6E). Darüber hinaus können Farbkarten, die die lokalen strukturellen Kollagenparameter über die gesamte Plaqueprobe zeigen, für die visuelle Analyse erhalten werden (Abbildung 6F,G). Für die repräsentative Testprobe in Abbildung 6 wird eine große Variation der strukturellen Kollagenparameter innerhalb der Probe gefunden (durchschnittliche ± SD von μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0,49 ± 0,14, wenn die Umfangsrichtung als 0° definiert ist). Diese Variation innerhalb der Stichprobe unterstreicht, wie wichtig es ist, lokale Strukturparameter zu erhalten, anstatt von Homogenität auszugehen. Mechanische PrüfungBruchverhaltenDie Hochgeschwindigkeitskamera liefert Bilder des Verformungs- und Bruchverhaltens der Plaqueproben während der mechanischen Prüfung (Abbildung 7). Aus diesen Bildern können der Ort der Bruchinitiierung und der Bruchausbreitungspfad identifiziert werden. Die Ergebnisse der Brucherkennung sind suboptimal, wenn Blasen oder Reflexionen in den Kamerabildern vorhanden sind oder wenn sich der Bruch zu schnell ausbreitet, um mit der gewählten Bildrate erfasst zu werden. Lokale DehnungsmusterDie digitale Bildkorrelationsanalyse der Kameraaufzeichnungen, die während des einachsigen Zugversuchs aufgenommen wurden, liefert die lokalen Gewebedeformationskarten, wie z. B. die in Abbildung 8 gezeigten Green-Lagrange-Dehnungskarten. Diese Karten zeigen die drei Dehnungskomponenten (εxx, εxy und εyy) am Rahmen vor der Bruchinitiierung an. Aus diesen Dehnungskarten können die durchschnittlichen Stämme in einer Region von Interesse und die lokale Dehnung an einer Stelle, wie z. B. der Bruchstelle, extrahiert werden. Für die repräsentative Stichprobe in Abbildung 8 zeigen die lokalen Dehnungsdaten eine große Intrastichprobenvariation. Für die repräsentative Testprobe in Abbildung 8 wird eine große Intrasample-Variation in den lokalen Stämmen gefunden (die Bereiche der beobachteten Stämme sind wie folgt: εxx = -0,30-0,17; εxy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Dies unterstreicht die Wichtigkeit, lokale Daten anstelle von Brutto-Durchschnittswerten zu erhalten, die unter der Annahme der Gewebehomogenität erhalten werden. Korrelation mechanischer und struktureller GewebeinformationenDie oben genannten Ergebnisse erlauben eine Assoziation des lokalen Verformungs- und Bruchverhaltens des Gewebes mit der Kollagenarchitektur. Sobald die Bruchstelle auf den Kameraaufnahmen identifiziert ist (Abbildung 9A), kann sie auf das Referenzkamerabild (Abbildung 9B) und den Mikroskopie-Kachelscan (Abbildung 9C) zurückgeführt werden. Dies zeigt die MPM-SHG-Kachel, an der der Bruch stattgefunden hat, und die strukturellen Parameter, die an dieser Kachel gefunden wurden (Abbildung 9D). Die Strukturparameter in der Kachel, in der der Bruch in einer repräsentativen Probe aufgetreten ist, sind μ p = 28°, σp = 19° und Pani = 0,6. Das gleiche Verfahren kann auch auf die nicht gerissenen Gewebestellen angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kartierung der Bruchstelle auf dem Referenzbild aus dem Bruchrahmen bei einem schlechten Fleckenmuster und unklaren natürlichen Orientierungspunkten eine Herausforderung darstellen kann. Wenn die natürlichen Orientierungspunkte des Gewebes nicht klar genug sind, kann die Co-Registrierung des Kachelscan-Overlays und der Hochgeschwindigkeitskamerabilder schwierig sein. Abbildung 1: Workflow-Diagramm des vorgestellten experimentellen Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Auswahl von Kacheln für die SHG-Bildgebung aus dem Kachelscan . (A) Testprobe, die in Silizium gepinnt ist. (B) Kachelscan der durch Hellfeldmikroskopie erhaltenen Testprobe. Die Kacheln, die für die SHG-Bildgebung ausgewählt werden, sind durch blaue Quadrate gekennzeichnet. (C) Projektion der maximalen Intensität der von der Unternehmensleitung definierten Erfolgskontrolle mit SHG. Maßstabsbalken = 140 μm (C). Abkürzungen: SHG = Erzeugung der zweiten Harmonischen; MPM = Multiphotonenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Plaque-Probe, die unter dem Objektiv des Multiphotonenmikroskops platziert wurde. Der Ort der Plaqueprobe wird durch eine phosphatgepufferte, mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischale gesichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Kundenspezifisches einachsiges Zugprüfgerät mit seinen verschiedenen Komponenten . (A) Gesamtüberblick über das System. Beachten Sie, dass die Schleifpapiereinsätze in den Klemmen sichtbar sind, da nur die unteren Klemmen angebracht sind. (B) Vergrößertes Bild der Klemmen des Zugprüfgeräts mit dem prüfbereiten Probekörper. Abkürzungen: PVC = Polyvinylchlorid; LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Ergebnisse der Gewebeentnahme und Probenvorbereitung aus repräsentativen Proben. (A) Frische und intakte Plaqueprobe, entnommen von einwilligenden Patienten, die sich einer Karotis-Endarteriektomie unterzogen haben. (B) 3D-Rekonstruktion aus einem μCT-Scan. Verkalktes Gewebe ist hellblau und nicht verkalkt rot dargestellt. Eine optimale Probe ohne verkalktes Gewebe konnte aus dem Bereich zwischen den blauen Linien gewonnen werden. (C) 3D-Rekonstruktion aus dem μCT-Scan, die eine suboptimale Plaque mit einem Überschuss an verkalktem Gewebe zeigt. Maßstabsleiste = 3 mm. Abkürzung: μCT = Mikro-Computertomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: MPM-SHG-Ergebnisse aus einer repräsentativen Stichprobe. (A) Übersicht über Kachelscans; Die ausgewählten Kacheln für die Bildgebung werden blau angezeigt. (B) MEP aus verschiedenen Kacheln. (C) Fasererkennung durch das FOA-Tool von einer ausgewählten Kachel . (D) Faserorientierungshistogramm von einer ausgewählten Kachel. (E) Faserorientierungshistogramm + Gaußsche Passform, aus der Kollagenstrukturparameter aus einer ausgewählten Kachel extrahiert werden können. (F) Darstellung der μ p (schwarze Orientierungslinie) und σp (Hintergrundfarbe) über die gesamte Plaqueprobe. (G) Darstellung der μp (Orientierung schwarze Linie) und Pani (Hintergrundfarbe) über die gesamte Plaqueprobe. Maßstabsbalken = 140 μm (B,C). Abkürzungen: MPM-SHG = Multiphotonenmikroskopie-Sekunden-Harmonische-Erzeugung; MEPs = Projektionen der maximalen Intensität; FOA = Faserorientierungsanalyse; μp = vorherrschender Faserwinkel; Pani = anisotrope Fraktion; σp = Standardabweichung der Faserwinkelverteilung; Piso = isotroper Anteil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 7: Rupturinitiierung und -ausbreitung in einer Plaque-Gewebeprobe während des Zugversuchsverfahrens.1) Vorgedehnter Zustand, intaktes Gewebe. 2) Bruchinitiierung – erster Rahmen, in dem der Bruch beobachtet wird. Die Brucheinleitungsstelle ist mit einem roten Quadrat markiert. 3 ) und 4) Bruchausbreitung. 5) Vollständiger Bruch der Plaqueprobe. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: Green-Lagrange-Dehnungsmuster einer repräsentativen Probe (εxx, εxy und εyy) am Rahmen vor dem Bruch, ermittelt mit DIC-Analyse. Mittelwert und Standardabweichung über die gesamte Plaque werden zusammen mit der Dehnung an der Rupturstelle angegeben. Abkürzungen: DIC = digitale Bildkorrelation; εxx = Längsdehnung; εxy = Scherung; εyy = Zugdehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 9: Überlagerungsbild der Bruchstelle (rotes Quadrat) auf Bildern. (A) Hochgeschwindigkeitskamerabild, bei dem der Bruch identifiziert wird (Bruchrahmen). (B) Hochgeschwindigkeitskamerabild, bei dem nur Vordehnung angewendet wird (Referenzrahmen). (C) Das durch Mikroskopie erhaltene Kachel-Scan-Bild. (D) Eine farbkodierte Karte, die lokale Kollagenstrukturparameter an verschiedenen Kacheln zeigt. Die μp (schwarze Orientierungslinie) und Pani (Hintergrundfarbe) über die gesamte Plaque-Probe werden dargestellt. Abkürzungen: μp = vorherrschender Faserwinkel; Pani = anisotrope Fraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die aktuelle Studie konzentrierte sich auf die Entwicklung einer Mechano-Imaging-Pipeline, um die Korrelation zwischen der lokalen Kollagenorientierung und -dispersion, den lokalen mechanischen Eigenschaften und dem Rupturverhalten von fibrösem atherosklerotischem Plaquegewebe zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll ist aus mehreren Gründen innovativ. Erstens ist dies das erste Mal, dass die digitale Bildkorrelation angewendet wurde, um die lokale Verformung von fibrösem Plaquegewebe unter mechanischer Belastung zu messen. Zweitens liefert dieses Protokoll die notwendigen Informationen, um den Zusammenhang zwischen dem lokalen Deformationsmuster und der lokalen Kollagenarchitektur des fibrösen Plaquegewebes zu analysieren. Die Bedeutung der lokalen Beurteilung wird sowohl durch die Stammdaten als auch durch die im Ergebnisabschnitt dargestellten Kollagendaten unterstrichen, die die heterogene Natur des Gewebes zeigen. Daher wird die Verwendung von Techniken, die eine lokale Beurteilung ermöglichen, wie sie in diesem Protokoll verwendet werden, für zukünftige Studien der Eigenschaften von fibrösen Plaques empfohlen.

Die Vorbereitung der Testprobe gehört zu den kritischen Schritten dieses Protokolls. Karotis-Plaques sind hauptsächlich kollagene Gewebe; Sie können jedoch Verkalkungen enthalten, von denen angenommen wird, dass sie das mechanische Verhalten der gesamten Plaque beeinflussen^36,37. Da sich die Studie auf die fibröse Gewebekomponente der Plaque konzentriert, werden Verkalkungen in den Testproben mittels μCT-Bildgebung vermieden³⁸. Wenn die μCT nicht verfügbar ist, können andere bildgebende Verfahren wie MRT oder OCT³⁹ in Betracht gezogen werden, um die verkalkten Regionen in der Plaque zu erkennen. Die Gewinnung von Testproben aus fibrösem Gewebe, die frei von Verkalkungen sind und eine Größe haben, die groß genug ist, um für mechanische Tests geeignet zu sein, kann eine schwierige Aufgabe für Plaques sein, die stark verkalkt sind oder dispergierte Verkalkungen enthalten. Eine weitere herausfordernde Aufgabe des Protokolls besteht darin, ein optimales Speckle-Muster für die digitale Bildkorrelation zu erzeugen. Optimaler DIC erfordert ein Schwarz-Weiß-Verhältnis von 50:50²⁸ und Sprenkel mit einer Größe von drei bis fünf Pixeln²⁹, um eine angemessene Qualität zu gewährleisten. Die Nichteinhaltung dieser Anforderungen kann zu ungenauen lokalen Dehnungsmessungen führen. Schließlich kann die Zuordnung der Rupturstelle zu den SHG-Bildern eine Herausforderung darstellen, wenn die natürlichen Orientierungspunkte eines Gewebes nicht klar sind. Bei solchen Proben ist die Anbringung mehrerer Passermarker auf das Gewebe vor der Bildgebung hilfreich.

Die MPM-SHG-Technik, die im aktuellen Protokoll verwendet wird, ist vielen anderen kollagenbildenden Verfahren überlegen, da es sich um eine hochauflösende und zerstörungsfreie Technik mit einer relativ großen Eindringtiefe handelt. Die Eindringtiefe (<400 μm) von MPM-SHG stellt jedoch eine Einschränkung dar, da sie es nicht erlaubt, die gesamte Dicke der Testproben abzubilden, die zwischen 0,5 und 2 mm lag. In einer kürzlich durchgeführten Studie mit Diffusionstensor-Magnetresonanztomographie (DT-MRT) haben wir gezeigt, dass sich die vorherrschende Faserorientierung in den tieferen Teilen des Plaquegewebes von der in den oberflächlicheren, luminalen Teilen des Gewebes unterscheiden kann¹⁴. Daher sind weitere Studien erforderlich, um die lokale Kollagenarchitektur in den tieferen Teilen dicker fibröser Plaquegewebeproben und ihre Beziehung zur lokalen Gewebemechanik zu untersuchen. Zu diesem Zweck kann die Bildgebung im polarisierten räumlichen Frequenzbereich (pSFDI) eingesetzt werden. Es wurde berichtet, dass diese kürzlich entwickelte optische Bildgebungstechnik das Potenzial hat, die Faserorientierung in Mitralklappensesseln bis zu 0,8 mm tief zu messen¹². Der pSFDI bietet auch eine schnelle Erfassung, die auch die Visualisierung des gesamten Probenbereichs erleichtern könnte, anstatt nur eine Auswahl von Kacheln, wie es im aktuellen Protokoll der Fall ist. Eine weitere Einschränkung des aktuellen Protokolls besteht darin, dass nur Oberflächenverformungen identifiziert werden konnten. In zukünftigen Studien können spiegelgestützte Multi-View-DIC⁴⁰ oder digitale Volumenkorrelation (DVC)⁴¹ in dieses Protokoll aufgenommen werden, um zusätzliche Informationen über die volumetrischen, unterirdischen Dehnungen zu erhalten.

Das aktuelle experimentelle Protokoll kann auf verschiedene Weise erweitert oder modifiziert werden, um zusätzliche Informationen über die Plaquerupturmechanik und ihre Beziehung zur zugrunde liegenden Mikrostruktur zu erhalten. Erstens beinhaltet das aktuelle Protokoll einen einachsigen Zugversuch in Umfangsrichtung. Diese Art der mechanischen Prüfung wurde gewählt, da die Plaque in vivo überwiegend eine Zugdehnung in Umfangsrichtung erfährt. Für eine umfassendere mechanische Charakterisierung kann dieses Protokoll weiter erweitert werden, um eine Aufblasprüfung, eine zweiachsige Prüfung oder eine einachsige Zugprüfung in Längsrichtung einzubeziehen. Zweitens konzentriert sich das aktuelle Protokoll nur auf die Gewinnung lokaler Stämme durch DIC. Ein vollständigerer Überblick über das mechanische Verhalten der Plaque kann jedoch gewonnen werden, indem auch die lokale Spannungsanalyse in das Protokoll aufgenommen wird, was jedoch eine Charakterisierung der lokalen Steifigkeit erfordert. Obwohl dies derzeit eine Herausforderung darstellt, kann dies durch Berechnungstechniken wie die inverse Finite-Elemente-Methode ^42,43 und die virtuelle Feldmethode⁴⁴ erreicht werden. Neben der experimentellen Anpassung können dem aktuellen Protokoll auch einige zusätzliche Nachbearbeitungsschritte hinzugefügt werden. Anstatt nur die Bruchstelle zu identifizieren, kann der Rissausbreitungspfad zunächst über die erhaltenen Hochgeschwindigkeitskamerabilder identifiziert werden. Dieser Ausbreitungspfad kann mit lokalen strukturellen und mechanischen Parametern korreliert werden. Zweitens wurde der Ort der Bruchinitiierung in dem beschriebenen Protokoll visuell identifiziert. Eine frühere Studie an nicht-biologischen Geweben hat Diskontinuitäten in DIC-Dehnungsmessungen verwendet, um Ruptur⁴⁵ zu erkennen. Die Anwendung einer solchen automatisierten Rupturerkennung auf Plaquegewebe kann möglicherweise die Genauigkeit der Rupturerkennung verbessern. Schließlich besteht ein großer Vorteil von MPM-SHG im Vergleich zu anderen kollagenbildenden Verfahren darin, dass es einzelne Kollagenfasern sichtbar macht. Daher können die über dieses Protokoll gewonnenen Daten auch verwendet werden, um zusätzliche lokale Kollageneigenschaften, wie z.B. den Kollagengehalt, zu untersuchen.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein besseres Verständnis der lokalen Eigenschaften von fibrösem Plaquegewebe zu ermöglichen, der Komponente, die bei der Plaqueruptur in vivo mechanisch versagt. Diese Informationen werden benötigt, um neue strukturelle und funktionelle Bildgebungsmarker zu etablieren, die eine Plaqueruptur bei Patienten vorhersagen. Diese neuen Marker sind notwendig, da sich gezeigt hat, dass die zuvor vorgeschlagenen Risikobiomarker einen suboptimalen prädiktiven Wert für zukünftige klinische Ereignisse haben ^5,6. In Zukunft können OCT und ps-OCT möglicherweise fibröses Gewebe im arteriellen System identifizieren und quantifizieren^46,47,48. Darüber hinaus wurde der Stamm als Surrogatmarker für die lokale Plaquezusammensetzung angesehen⁴⁹. Daher könnten In-vivo-Stammmessungen ⁴⁹ möglicherweise bei der Identifizierung der Plaquestabilität bei Patienten helfen. Man sollte jedoch vorsichtig sein, wenn man die erhaltenen Ergebnisse direkt in eine In-vivo-Plaqueruptur übersetzt. Erstens erfährt das fibröse Plaquegewebe in vivo eine komplexere Belastung als die unidirektionale Zugbelastung, die in diesem Protokoll verwendet wird. Zweitens sind atherosklerotische Plaques Mehrkomponentenstrukturen; Die In-vivo-Spannungs- und Dehnungsverteilungen im fibrösen Plaquegewebe können durch das Vorhandensein und die Lage der anderen Plaquekomponenten, wie z. B. Verkalkungen, beeinflusst werden³⁷.

Diese Mechano-Imaging-Pipeline kann auch zur Untersuchung anderer kollagener Gewebe verwendet werden. Globale mechanische Tests und strukturelle Bildgebung von Kollagen sind bereits weit verbreitet für biologische Gewebe. Die lokale Beurteilung der Eigenschaften vor und des Versagens sowie der Kollagenarchitektur ist jedoch entscheidend für die genaue mechanische Charakterisierung heterogener Fasergewebe. Wir gehen davon aus, dass die Struktur dieses neuen Protokolls weitere Einblicke in das Zusammenspiel zwischen der Mikrostruktur und der Mechanik mehrerer biologischer Gewebe geben wird.

Materials

10 mm extension ring	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL tube	VWR	525-0150
20x APO water immersion objective	Leica	507701
3D Slicer software	N/A	Version 4.11
50 mL tubes	VWR	525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating	Thorlabs
Black tissue dye	Polysciences inc	24113-2
Camera lens, focal length 50 mm	Thorlabs Inc.	MVL50M1
Camera stand	VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser	Coherent
Compressor + air hose	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm	Pattex
Heating bath	N/A		Custom made
High-speed camera + imaging software	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery)	N/A
Image J	National Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	Version 2.3	Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II	Leica		Microscope used for SHG imaging
Lighting system	AMZ instruments	LED-60TB	Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB	MathWorks	Version R2021A
MATLAB-based FibLab software	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based Ncorr software	Georgia Institute of Technology	Version 1.2
Needles	Emerald	BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
Pasteur Pipettes	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
Sandpaper (P180)	Conrad	4.00932E+12
Side cutter	Conrad	4.25084E+12
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tensile tester + software + clamps	N/A		Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver	Garant, Hoffman group	659906