Bioengineering

طريقة لدراسة العلاقة بين بنية الكولاجين المحلي والخواص الميكانيكية للأنسجة الليفية اللويحية تصلب الشرايين

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334

Hanneke Crielaard¹, Su Guvenir Torun¹, Tamar B. Wissing^1,2, Pablo de Miguel Muñoz^1,3, Gert-Jan Kremers⁴, Frank J. H. Gijsen^1,3, Kim Van Der Heiden^1,2, Ali C. Akyildiz^1,3

¹Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, ³Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, ⁴Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

لقد طورنا خط أنابيب التصوير الميكانيكي لدراسة خصائص اللويحات الهيكلية والميكانيكية غير المتجانسة. يتيح خط الأنابيب هذا الارتباط بين الزاوية السائدة المحلية وتشتت اتجاه ألياف الكولاجين ، وسلوك التمزق ، وبصمات الإجهاد لأنسجة البلاك الليفية.

Abstract

تمزق لويحات تصلب الشرايين في الشرايين التاجية والشريان السباتي هو السبب الرئيسي لأحداث القلب والأوعية الدموية القاتلة. ومع ذلك ، فإن ميكانيكا تمزق أنسجة البلاك غير المتجانسة عالية الكولاجين ، وكيف يرتبط ذلك بالبنية الليفية للأنسجة ، غير معروفة بعد. تقتصر خطوط الأنابيب الحالية لدراسة ميكانيكا البلاك على الحصول فقط على الخصائص الميكانيكية الإجمالية لأنسجة البلاك ، بناء على افتراض التجانس الهيكلي للنسيج. ومع ذلك ، فإن أنسجة البلاك الليفي غير متجانسة من الناحية الهيكلية ، ويمكن القول إن ذلك يرجع أساسا إلى الاختلاف المحلي في بنية ألياف الكولاجين.

تم تطوير خط أنابيب التصوير الميكانيكي الموصوف هنا لدراسة خصائص البلاك الهيكلية والميكانيكية غير المتجانسة. في خط الأنابيب هذا ، تتميز بنية الكولاجين المحلية للأنسجة باستخدام المجهر متعدد الفوتونات (MPM) مع الجيل التوافقي الثاني (SHG) ، ويتميز سلوك فشل الأنسجة في ظل ظروف اختبار الشد أحادي المحور باستخدام تحليل ارتباط الصورة الرقمية (DIC). يتيح خط الأنابيب التجريبي هذا الارتباط بين الزاوية السائدة المحلية وتشتت اتجاه ألياف الكولاجين ، وسلوك التمزق ، وبصمات الإجهاد لأنسجة البلاك الليفي. المعرفة التي تم الحصول عليها هي المفتاح لفهم أحداث تمزق البلاك تصلب الشرايين والتنبؤ بها ومنعها بشكل أفضل.

Introduction

السكتة الدماغية الإقفارية ، التي غالبا ما تسببها تمزق اللويحات تصلب الشرايين في الشرايين السباتية ، هي أحد الأسباب الرئيسية للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم¹. ومع ذلك ، فإن استراتيجيات تخطيط العلاج الجراحي الحالية للوقاية من السكتة الدماغية المرتبطة بتصلب الشرايين السباتي لا تشمل تقييم مخاطر تمزق البلاك². ويرجع ذلك أساسا إلى أن المؤشرات الحيوية للمخاطر المقترحة سابقا ، مثل سمك غطاء البلاك³ وحجم لب الدهون⁴ ، قد ثبت أن لها قيمة تنبؤية دون المستوى الأمثل للأحداث السريرية المستقبلية ^5,6. من الضروري فهم آليات تمزق البلاك وآليات التمزق بشكل أفضل لتحسين تقييم مخاطر تمزق البلاك وتحديد علامات الخطر الجديدة لويحات تصلب الشرايين.

تمزق البلاك هو حدث ميكانيكي محلي حيث يفشل نسيج اللويحات شديد الليف في تحمل الحمل الميكانيكي الذي يمارسه ضغط الدم عليه ويفقد سلامته الهيكلية⁷. على الرغم من ذلك ، فإن آليات حدث تمزق البلاك وارتباطه بالبنية المجهرية الأساسية غير مفهومة^{بشكل جيد 8}. الدراسات التجريبية القليلة التي ميزت فشل أنسجة البلاك تتميز^{بخصائص 9}،¹⁰،¹¹،¹²،¹³ذكرت خصائص التمزق الميكانيكي الإجمالي (أي إجهاد فشل الشد النهائي وقوته) ^، مشتقة من افتراض التجانس الهيكلي للأنسجة. ومع ذلك ، فإن نسيج البلاك الليفي غير متجانس من الناحية الهيكلية ، ويمكن القول إنه يرجع أساسا إلى الاختلاف المحلي في بنية ألياف الكولاجين¹⁴. علاوة على ذلك ، تم التحقيق في العلاقة بين خصائص الفشل الميكانيكي لأنسجة البلاك وبنية الكولاجين فقط في دراسة حديثة أجراها جونستون وآخرون. أظهر المؤلفون اختلافا بين اللويحات في اتجاه الألياف السائد وأبلغوا عن ضغوط نهائية أعلى وسلالات نهائية أقل لعينات غطاء البلاك الليفي مع اتجاه الألياف المحيطية^{في الغالب 15}. ومع ذلك ، اقتصرت الدراسة أيضا على الخصائص الميكانيكية والهيكلية الإجمالية.

لإلقاء الضوء على المعلومات الأساسية حول بنية الكولاجين المحلية والخصائص الميكانيكية المحلية لأنسجة البلاك الليفي ، في الدراسة الحالية ، قمنا بتطوير خط أنابيب التصوير الميكانيكي. يتيح خط الأنابيب خارج الجسم الحي هذا القياس الكمي لاتجاه ألياف الكولاجين المحلية وتشتتها ، بالإضافة إلى إجهاد التمزق المحلي. يتضمن خط الأنابيب تصوير MPM باستخدام SHG لتصوير ألياف الكولاجين في أنسجة البلاك ، بالإضافة إلى DIC واختبار الشد أحادي المحور لتحديد خصائص تمزق الأنسجة.

أصبح المجهر متعدد الفوتونات - الجيل الثاني التوافقي (MPM-SHG) تقنية شائعة لدراسة الكولاجين في الأنسجة البيولوجية¹⁶. تتمتع هذه التقنية بالعديد من المزايا مقارنة بتقنيات تصوير الكولاجين الأخرى ، مثل الأنسجة¹⁷ ، وتصوير موتر الانتشار (DTI) 14 ، وتشتت الضوء بزاوية صغيرة (SALS) ¹⁵. أولا ، تصوير MPM-SHG غير مدمر ، مما يجعله مثاليا للاندماج مع الاختبار الميكانيكي¹⁸. ثانيا ، إشارة SHG خاصة بالكولاجين ، وبالتالي لا يلزم تلطيخ الأنسجة. نظرا للأطوال الموجية الطويلة للإثارة (القريبة من الأشعة تحت الحمراء) ، يكون عمق الاختراق أكبر من تقنيات الفحص المجهري الأخرى¹⁶. تسمح الدقة العالية (مستوى ميكرومتر) التي تم تحقيقها باستخدام تصوير SHG أيضا بتصور الألياف الفردية. يوفر هذا العديد من الاحتمالات ، مثل القياس الكمي المحلي لعدد ألياف الكولاجين ، واتجاه ألياف الكولاجين ، والتوزيع¹⁹.

يعد ارتباط الصورة الرقمية (DIC) جنبا إلى جنب مع الاختبار الميكانيكي طريقة مستخدمة على نطاق واسع للحصول على الخواص الميكانيكية المحلية للأنسجة البيولوجية²⁰. مع مدينة دبي للإنترنت ، يتم تتبع إزاحة البقع المطبقة على سطح الأنسجة من خلال مقارنة صور الكاميرا عالية السرعة التي تم الحصول عليها أثناء الاختبار الميكانيكي²⁰. تستخدم طريقة المعالجة اللاحقة للصور هذه لتقدير سلالات سطح المجال الكامل للعينة²⁰ ويمكن استخدامها أيضا لدراسة سلوك تمزق الأنسجة²¹.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة في هذه الورقة من قبل لجنة البحوث الأخلاقية في مركز إيراسموس الطبي في روتردام. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى قبل جمع عينات البلاك. ويرد مخطط سير العمل للبروتوكول في الشكل 1.

1. جمع الأنسجة ، التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) ، وإعداد عينة الاختبار

جمع الأنسجة وتخزينها
1. اجمع عينات جديدة من اللويحات السباتية البشرية من المرضى الذين خضعوا لجراحة استئصال باطنة الشريان السباتي.
  ملاحظة: تتكون عينات البلاك التي تم استردادها من هذه الجراحة من طبقة بطانة المريضة من الشريان السباتي ، بما في ذلك تراكم الدهون (بركة الدهون) والتكلسات²².
2. قم بإزالة بقايا الدم باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) وجفف العينة باستخدام وسادة شاش.
3. ضع العينة في أنبوب سعة 15 مل باستخدام الملقط. قم بتجميد الأنسجة عن طريق وضع الأنبوب في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق.
4. بعد التجميد المفاجئ ، قم بتخزين العينة في مجمد -80 درجة مئوية حتى يوم التصوير المقطعي.
  ملاحظة: يقلل التجميد المفاجئ من تكوين البلورات ، مما يؤدي إلى تلف البنية المجهرية في الأنسجة. أظهرت دراسة سابقة على أنسجة الأبهر الخنازير أن التجميد المفاجئ والتخزين عند -80 درجة مئوية لم يكن له تأثير كبير على الخواص الميكانيكية للأنسجة²³.
التصوير المقطعي المحوسب
1. في يوم التصوير المقطعي المحوسب ، أخرج عينة البلاك من أنبوب 15 مل. إذا التصق النسيج بالأنبوب ، املأ الأنبوب ب PBS في درجة حرارة الغرفة. اترك المنديل في برنامج تلفزيوني حتى يمكن إخراج العينة من الأنبوب.
2. تجفيف عينة البلاك جيدا مع المناديل الورقية.
3. قم بتشغيل نظام μCT بالضغط على الزر الأخضر . اضغط على الاحماء في برنامج التصوير المقطعي المحوسب في الجزء السفلي من الشاشة وانتظر 15 دقيقة.
4. ضع يدويا مرشح الأشعة السينية من النحاس 0.06 مم + Al 0.5 مم في نظام μCT.
5. حدد المجلد الذي سيتم تخزين الصور فيه.
6. اختر المعلمات في اللوحة اليمنى. استخدم القوائم المنسدلة لتحديد وقت مسح يبلغ 4 دقائق ، ودقة 172 ميكرومتر ، وجهد 90 كيلو فولت ، وتيار 88 مللي أمبير ، ومجال رؤية 86 مم ، ودوران 360 درجة.
7. افتح باب الجهاز. اسحب المنصة للخارج يدويا.
8. ضع parafilm على المنصة وضع العينة على المنصة (باتجاه أقصى المنصة).
9. ضع المنصة يدويا في الجهاز وأغلق الباب.
10. قم بتنشيط الوضع المباشر (أيقونة العين ). حرك النظام الأساسي مع الأسهم الموجودة في الجهاز لتوسيط العينة في مجال الرؤية.
11. ابدأ التصوير (الرمز في أسفل الوسط). بمجرد الانتهاء من التصوير ، اضغط على أيقونة الباب في الأسفل (أسفل زر الإجهاض ).
12. بعد فحص μCT ، قم بتجميد عينة البلاك مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 1.1.3. قم بتخزينه في -80 درجة مئوية حتى يوم التصوير المجهري متعدد الفوتونات والاختبار الميكانيكي.
13. افتح ملفات DICOM التي تم الحصول عليها من التصوير μCT في برنامج 3D Slicer مفتوح المصدر²⁴.
14. انتقل إلى محرر التقسيم . حدد إنشاء تجزئة جديدة | وحدة التخزين المراد تحليلها كوحدة تخزين رئيسية.
15. انقر فوق إضافة لإضافة شريحة. اضغط على اسمه ولونه لتغيير هذه المعلمات.
16. لتحديد الشرائح ، انقر فوق عتبة التأثيرات | في الجزء السفلي من النافذة. استخدم أداة العتبة هذه للتمييز بين مناطق الأنسجة المتكلسة (>450 HU) وغير المتكلسة (<450 HU). بمجرد تحديد الحد ، اضغط على Apply في الجزء السفلي.
17. اضغط على Show 3D (على يمين الإضافة مباشرة) لتصور التجزئة في طريقة العرض ثلاثية الأبعاد. إذا كانت هناك مناطق من التجزئة غير مرغوب فيها ، فقم بإزالتها باستخدام تأثير المقص .
18. قم بتغيير عتامة المقاطع في وحدة التجزئة بالنقر فوق اسم التجزئة المطلوبة.
  ملاحظة: إذا أمكن ، يمكن إجراء تصوير μCT ومراجعة صور μCT في نفس يوم بقية البروتوكول. في هذه الحالة ، تخطي الخطوة 1.2.12. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن الخطوات اللاحقة لهذا البروتوكول تستغرق وقتا طويلا ويجب تنفيذها في نفس اليوم. بعد بعض الممارسة ، ومع الإعدادات والأنسجة الموصوفة ، يجب أن يستغرق التصوير المقطعي ~ 45 دقيقة ، ومراجعة صور μCT ~ 15 دقيقة ، وإعداد عينة الاختبار لعينة اختبار واحدة ~ 1 ساعة ، والفحص المجهري ~ 4 ساعات ، واختبار الشد أحادي المحور ~ 2 ساعة.
إعداد عينة الاختبار
1. في يوم تصوير الكولاجين والاختبار الميكانيكي ، قم بإذابة البلاك عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا.
2. افتح البنية ثلاثية الأبعاد للوحة التي تم إنشاؤها في الخطوات 1.2.13-1.2.18 في برنامج مقسم طريقة العرض ثلاثية الأبعاد.
3. استخدم المعالم الطبيعية لأنسجة البلاك لتحديد أجزاء إعادة الإعمار 3D التي تتوافق مع عينة البلاك الحقيقية. تحديد أي منطقة من إعادة الإعمار 3D لا تحتوي على تكلسات وتحديد بصريا هذه المنطقة في اللوحة الحقيقية.
4. قطع اللوحة مفتوحة على طول المحور الطولي للشريان باستخدام مقص جراحي وملاقط. إذا كان هناك قطع موجود بالفعل من الجراحة ، فابدأ من هذا القطع للاستخدام الأمثل للأنسجة. إذا لم يكن للعينة شكل أنبوبي وكان من الصعب تحديد الاتجاه الطولي ، فاستبعد العينة من الاختبار.
5. قطع عينات اختبار مستطيلة من عينات البلاك. تأكد من أن عينات الاختبار كبيرة قدر الإمكان مع تجنب مناطق الأنسجة التي تحتوي على تمزقات أو تكلسات. كن حذرا أثناء هذا القطع ، حيث يمكن أن يؤدي تمزق صغير أو صدع على حافة عينة الاختبار إلى انتشار الشقوق من الشق الموجود أثناء اختبار الشد.
6. تأكد من أن عينات الاختبار لها نسبة عرض إلى طول (WL) تبلغ <1 في طول المقياس بمجرد تركيبها في جهاز اختبار الشد. إذا كانت العينات تفي بهذا المطلب ، فهي مناسبة لاختبارات الشد المناسبة من حيث شروط الحدود²⁵.
  ملاحظة: يمكن أن يكون النطاق في أبعاد العينة كبيرا. العينات التي اختبرها المؤلفون كان لها طول مقياس يتراوح بين 3.4 و 12.9 ملم وعرض يتراوح بين 1.6 و 6.4 ملم.

2. التصوير المجهري متعدد الفوتون

التحضيرات
1. قبل يوم تصوير الكولاجين والاختبار الميكانيكي ، قسم 40 جم من قاعدة مطاط السيليكون على أنبوبين سعة 50 مل وأضف 2 جم من عامل المعالجة إلى كل أنبوب (نسبة 1:10) باستخدام ماصة باستور. امزج المكونين مع الماصة.
2. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 1 دقيقة في 700 × غرام لإزالة أكبر عدد ممكن من فقاعات الهواء.
3. املأ طبق بتري (قطره 10 سم) بطبقة رقيقة (حوالي 0.5-1 سم) من السيليكون واحتضانه في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أو ضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.
4. خذ عينة اختبار البلاك وقم بتثبيت طرفيها على السيليكون عن طريق تثبيت الإبر في الأنسجة (الشكل 2 أ). تأكد من أن الجانب اللمعي من العينة متجها لأعلى. أدخل الإبر في منطقة العينة التي ستكون في مشابك جهاز اختبار الشد أثناء الاختبار الميكانيكي.
5. ارتد نظارات السلامة. استخدم قاطعا جانبيا لتقصير الإبر بحيث تبرز أقل من بضعة ملليمترات فوق سطح العينة ، لمنعها من إتلاف هدف المجهر. املأ طبق بتري ببرنامج تلفزيوني حتى تغمر العينة.
إعداد الفحص المجهري
1. تأكد من تثبيت الهدف المناسب على المجهر متعدد الفوتونات. استخدم هدفا محسنا لنقل ضوء الأشعة تحت الحمراء ، مع تكبير 20x.
2. بدء تشغيل نظام المجهر. افتح برنامج تشغيل المجهر.
3. عندما يطلب منك تهيئة جدول التصوير ، تأكد من دفع ذراع مكثف المجهر للخلف وأن الهدف في أدنى موضع.
4. قم بتنشيط الليزر متعدد الفوتونات.
5. ضع طبق بتري مع عينة الاختبار فيه أسفل الهدف ، كما في الشكل 3. تأكد من عدم وضع الهدف فوق العينة حتى الآن حيث لا تزال إعدادات الليزر بحاجة إلى التحسين. خلاف ذلك ، قد تؤدي الطاقة العالية المحتملة لضوء الليزر إلى تلف الأنسجة.
6. تأكد من أن الهدف مغمور قليلا في برنامج تلفزيوني. استخدم ماصة لإضافة PBS إضافي إذا لزم الأمر.
7. اضبط الطول الموجي للضوء على 880 نانومتر.
  ملاحظة: يتم اختيار هذا الطول الموجي لأن مرشح انبعاث SHG في نظام الفوتون الثنائي المستخدم له طول موجي مركزي يبلغ حوالي 440 نانومتر. بالنسبة للمجاهر الأخرى ، قد يكون الطول الموجي المختلف أكثر قابلية للتطبيق.
مسح البلاط واختيار مواقع التصوير
1. قم بإيقاف تشغيل الليزر متعدد الفوتون وتنشيط وضع برايت فيلد للمجهر. ثم قم بتشغيل وضع المسح المباشر .
2. ضع المرحلة بحيث يكون الهدف فوق العينة واجعل سطح العينة موضع تركيز. قم بإيقاف تشغيل وضع المسح المباشر .
3. ضمن علامة التبويب الاستحواذ ، في اللوحة الثانية ، قم بتغيير عامل التكبير / التصغير إلى 1 عن طريق تحريك الشريط المقصود.
  ملاحظة: يحدد عامل التكبير/التصغير هذا، إلى جانب عامل التكبير للهدف (20x)، حجم الصورة الملتقطة (739 ميكرومتر × 739 ميكرومتر).
4. ضمن علامة التبويب الاكتساب ، في اللوحة الثانية ، قم بتغيير سرعة المسح الضوئي إلى 400 هرتز ، ومتوسط الخط إلى 1 ، والدقة إلى 128 × 128 بكسل لكل صورة (حجم البكسل ~ 5.8 ميكرومتر × 5.8 ميكرومتر) باستخدام القوائم المنسدلة.
5. ضمن علامة تبويب الاستحواذ، في اللوحة الأولى، انقر فوق رمز النمط النقطي وانتظر حتى تظهر لوحة مسح التجانب .
6. قم بتشغيل وضع الفحص المباشر . انقل الهدف إلى زاوية من العينة باستخدام المقابض الموجودة على اللوحة الذكية وانقر رمز موضع العلامة في لوحة مسح التجانب. كرر ذلك لكل ركن من أركان العينة. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، فستظهر شبكة بها جميع المربعات المحددة للتصوير باللون البرتقالي.
7. قم بإيقاف تشغيل وظيفة الخياطة التلقائية .
8. انقر فوق ابدأ في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة لإنشاء مسح تجانب لسطح العينة بالكامل للحصول على نظرة عامة على هندسة العينة.
  ملاحظة: استنادا إلى الإعدادات الموصوفة والأنسجة ونظام المجهر ، يستغرق الحصول على مسح البلاط لسطح العينة بالكامل ~ 10 دقائق.
9. بعد مسح البلاط ، لاحظ إحداثيات x و y للزاوية اليسرى العليا من كل بلاطة في لوحة مسح البلاط ، والتي تظهر تلقائيا بواسطة برنامج نظام الفحص المجهري. لاحظ هذه الإحداثيات في جدول بيانات.
10. في برنامج المجهر ، في لوحة مسح البلاط ، لاحظ عدد المربعات في الاتجاهين x و y في المربع المسمى scanfield. لاحظ حجم فحص التجانب في جدول البيانات. احسب إحداثيات البلاطات الأخرى عن طريق إضافة / طرح حجم البلاطة (739 ميكرومتر).
  ملاحظة: هذه الإحداثيات ضرورية لتحديد الموقع الدقيق للبلاط المراد مسحه ضوئيا باستخدام تصوير SHG. إذا لم يكن إجمالي وقت التصوير مصدر قلق ، فيمكن تصوير جميع اللوحات دون تخطي أي تجانب.
11. من مسح التجانب، حدد اللوحات المراد تصويرها باستخدام تصوير SHG. بالنسبة لهذا التحديد ، تجنب البلاط الذي سيكون في المشابك واترك بلاطة واحدة بين كل بلاطة محددة في كل من الاتجاه الطولي والمحيطي ، كما هو موضح في الشكل 2 ب.
تصور الكولاجين: تصوير SHG
1. أطفئ الأنوار في الغرفة وقم بتغطية مرحلة المجهر بنسيج معتم أيضا حتى لا يصل أي ضوء من الغرفة إلى الكاشف.
  ملاحظة: سيؤدي تقليل الضوء الذي يصل إلى أجهزة الكشف إلى تقليل الضوضاء أثناء التقاط الصورة.
2. قم بتشغيل الليزر متعدد الفوتون (MP).
3. حدد كاشف الكشف غير الممسوح ضوئيا (NDD) المزود بمرشح تمرير النطاق 430-450 نانومتر.
4. حدد موقع اللوحات المراد تصويرها باستخدام المعلومات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.10. املأ الإحداثيات في المربعات المخصصة وانقر فوق Enter ، بحيث ينتقل الهدف إلى البلاط الأيمن. قم بتشغيل وضع الفحص المباشر.
  ملاحظة: باستخدام المجاهر الأخرى أو الإصدارات الأحدث من برنامج التشغيل، يمكن الانتقال إلى مواقع داخل فحص التجانب تلقائيا. في هذه الحالة ، ليس من الضروري ملاحظة إحداثيات x و y لكل بلاطة (الخطوة 2.3.10) وملء الإحداثيات في برنامج التشغيل (الخطوة 2.4.4).
5. قم بزيادة طاقة الليزر MP باستخدام شريط التمرير في اللوحة العلوية أسفل إعدادات مسار الشعاع للحصول على أعلى طاقة ليزر ممكنة دون تبييض كبير. بعد ذلك ، اضبط كسب الكاشف للحصول على صور ساطعة ، ولكن بدون وحدات بكسل مشبعة ، باستخدام المقبض الموجود على اللوحة الذكية أو بالنقر فوق اسم الكاشف ضمن إعدادات مسار الشعاع | قنوات إضافية. تتراوح القيم النموذجية لكسب الكاشف بين 500 و 800 فولت.
6. استخدم مقبض موضع z على اللوحة الذكية لضبط مستوى التركيز البؤري.
7. انتقل إلى أعلى العينة وقم بتعيين مواضع الجزء العلوي من z-stack بالنقر فوق رأس السهم في لوحة z-stack (ضمن علامة التبويب الاستحواذ | لوحة 3).
8. بعد ذلك ، ركز على العينة حتى لا يتم اكتشاف إشارة SHG - هذه هي نهاية المكدس. مرة أخرى ، انقر فوق رأس السهم في لوحة z-stack لتعيين هذا الموضع. عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل وضع المسح المباشر .
  ملاحظة: قد لا يكون النسيج مسطحا تماما. ومن ثم، قد يكون لسطح العينة في مناطق مختلفة داخل النسيج مواضع مختلفة قليلا في الاتجاه z.
9. ضمن علامة التبويب الاكتساب ، في اللوحة الثانية ، حافظ على سرعة المسح الضوئي عند 400 هرتز ، واضبط متوسط الخط على 2 ، والدقة على 512 × 512 بكسل لكل صورة (حجم البكسل ~ 1.4 ميكرومتر × 1.4 ميكرومتر) باستخدام القوائم المنسدلة. قم بالتبديل إلى زر المسح الضوئي X ثنائي الاتجاه.
10. انقر فوق حجم z-step في لوحة z-stack واملأ حجم z-step يبلغ 3 ميكرومتر في المربع. انقر فوق ابدأ في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة لإنشاء مكدس z. عند الانتهاء ، تأكد من حفظ إحداثيات البلاط في اسم الملف أو إعطاء كل بلاطة رقمها الخاص (كما في الشكل 2B).
  ملاحظة: استنادا إلى الإعدادات الموصوفة والأنسجة ونظام المجهر ، يستغرق الحصول على مكدس z من بلاط واحد ~ 10-15 دقيقة. يتم تضمين خطوات التحضير (الخطوات 2.4.4-2.4.10) ضمن هذا التقدير الزمني.

3. الاختبار الميكانيكي

إعداد إعداد اختبار الشد أحادي المحور
1. اجعل إعداد اختبار الشد الأفقي (الشكل 4) جاهزا للاستخدام ، باتباع الإرشادات الخاصة بجهاز اختبار الشد (على سبيل المثال ، قم بتشغيل البرنامج ، وإرفاق المشابك ، وإرفاق خلية التحميل).
2. لتقليل انزلاق عينة الاختبار ، قم بتوصيل شريط رغوي على الوجهين (الشكل 4A ، B-2) بالوجوه الداخلية لمشابك جهاز اختبار الشد وورق الصنفرة بالجانب الداخلي لشريط الرغوة. في النهاية ، سيكون ورق الصنفرة على اتصال بعينة الاختبار.
3. ضع حمام التدفئة (الشكل 4 أ ، ب -3) في موضعه. املأ حمام التدفئة ب PBS حتى مستوى الوجه السفلي للمشابك ، بحيث لا يصل إلى ورق الصنفرة بعد.
4. قم بتشغيل مصدر الطاقة لحمام التدفئة واضبط درجة الحرارة على حوالي 37 درجة مئوية.
5. قم بتركيب الكاميرا عالية السرعة فوق نظام اختبار الشد (الشكل 4A-4) ، على سبيل المثال ، باستخدام حامل مختبر ، وقم بتركيب عدسة بطول بؤري يبلغ 50 مم على الكاميرا من خلال حلقة تمديد.
6. تأكد من أن المشابك في بؤرة التركيز وأن مجال الرؤية كبير بما يكفي لتسجيل العينة أثناء إجراء التمدد بالكامل (عرض مجال الرؤية: ± عرض العينة ؛ طول مجال الرؤية: ± 2x طول العينة).
7. قم بتركيب نظام الإضاءة (الشكل 4A-5) فوق نظام اختبار الشد ، على سبيل المثال ، باستخدام حامل مختبري. قم بتشغيل نظام الإضاءة واضبط شدة الضوء وموقعه بحيث لا توجد انعكاسات على سطح PBS يمكن ملاحظتها على صورة الكاميرا.
8. اضبط وقت التعرض للضوء وكسب الكاميرا للحصول على صور واضحة.
9. اضبط برنامج الحصول على الصور لالتقاطه بمعدل 30 إطارا / ثانية بدقة 5.2 ميجابكسل.
  ملاحظة: هناك حاجة إلى معدل الإطارات المرتفع هذا لإجراء تحليل DIC اللاحق ودراسة سلوك التمزق.
10. اضبط سرعة الإزاحة لأحد المشابك بحيث يكون معدل الإجهاد الهندسي العالمي أثناء الاختبار الميكانيكي مشابها لمعدل الإجهاد الفسيولوجي للأنسجة في الجسم الحي
  (5٪ / ثانية لأنسجة البلاك²⁶).
توليد نمط البقع
ملاحظة: يعتمد بروتوكول نمط البقع هذا على العمل السابق الذي قام به Walsh et ^al.27.
1. جفف العينة عن طريق غمسها برفق بالمناديل الورقية.
2. ضع صبغة الأنسجة السوداء في الدلو المقصود من البخاخة.
3. قم بتوصيل البخاخة بالضاغط. قم بتشغيل ضاغط البخاخة واضبط الضغط على 25 رطل لكل بوصة مربعة.
4. حاول إنشاء نمط بقع مثالي على الورق قبل الرش على المنديل. رش عدة مرات حتى يتم استيفاء نسبة أبيض / أسود من 50 :50²⁸ . حرك إبرة البخاخة ذهابا وإيابا لضبط خشونة نمط البقع حتى يصبح حجم البقعة مشابها لحجم 3-5 بكسل للكاميرا عالية السرعة²⁹.
  ملاحظة: سيتم استخدام نمط البقع لغرضين مختلفين. أولا ، يتم قياس إزاحة هذه البقع من خلال مقارنة صور الكاميرا عالية السرعة التي تم الحصول عليها أثناء الاختبار الميكانيكي (مدينة دبي للإنترنت ، الخطوة 4.2). ثانيا ، يستخدم نمط البقع هذا لتحديد موقع التمزق على صورة الحالة غير المشوهة للعينة (الخطوة 4.3.1).
5. أمسك البخاخة على بعد 30 سم تقريبا من عينة الاختبار ورشها على سطح اللمعة.
6. دع الصبغة تلتصق بالعينة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل غمر العينة في برنامج تلفزيوني.
اختبار الشد أحادي المحور
1. ضع العينة في مشابك جهاز اختبار الشد ، مع محاذاة الاتجاه المحيطي للعينات مع اتجاه تمدد الشد والجانب اللمعي للعينة متجها لأعلى. تأكد من ضبط طول المقياس الأولي بحيث تكون نسبة WL للشرائط <1.
2. أحكم ربط مسامير المقابض عن طريق تطبيق عزم دوران يبلغ 20 نيوتن متر باستخدام مفك عزم الدوران. قم بذلك تدريجيا عن طريق تطبيق عزم دوران صغير على كل برغي قبل تطبيق عزم الدوران النهائي.
3. افحص بصريا ما إذا كانت العينة تحتوي على أي تمزقات يمكن أن تؤثر على الاختبارات.
4. أدخل المزيد من PBS في حمام التدفئة حتى يتم غمر العينة وانتظر حتى تصل درجة حرارة PBS إلى 37 درجة مئوية مرة أخرى.
5. احصل على صورة معايرة باستخدام الكاميرا عالية السرعة ، حيث يتم تضمين عينة الاختبار والمسطرة كمرجع. تأكد من أن المسطرة على نفس المسافة من هدف الكاميرا مثل السطح اللمعي للعينة.
6. قم بتفريغ خلية الحمل وابدأ في تسجيل قياسات القوة والإزاحة العالمية من خلية الحمل ومشغل جهاز اختبار الشد.
7. قم بتصويب العينة عن طريق تطبيق تمدد مسبق قدره 0.05 نيوتن للتخلص من الركود في العينة. قم بإجراء 10 دورات من التكييف المسبق بنسبة تصل إلى 10٪ إجهاد بناء على قياس طول المقياس بواسطة المشغل بعد تطبيق التمدد المسبق.
8. ابدأ اختبار الشد أحادي المحور حتى الفشل الكامل للعينة ، أثناء تسجيل مقطع فيديو لتشوه العينة بالكاميرا عالية السرعة. بعد فشل الأنسجة ، توقف عن تسجيل قياسات القوة العالمية والإزاحة.
  ملاحظة: يمكن لبعض أجهزة اختبار الشد التجارية تنفيذ الخطوات من 3.3.6 إلى 3.3.9 تلقائيا. يصف البروتوكول الحالي الخطوات اليدوية التي يجب اتخاذها إذا لم يتم تضمين هذا الخيار التلقائي في جهاز اختبار الشد المستخدم.
9. قم بإزالة عينة الاختبار من جهاز اختبار الشد وتخلص منها بشكل مناسب.
10. عند اختبار العينة التالية ، استبدل ورق الصنفرة والشريط الرغوي على المشابك.

4. تحليل البيانات

تحليل تنظيم الكولاجين
1. افتح مكدسات z التي تم الحصول عليها أثناء MPM باستخدام SHG في ImageJ وقم بإنشاء إسقاطات كثافة قصوى (MIPs) لكل مكدس z.
2. قم بتحليل كل MIP باستخدام أداة FOA (تحليل اتجاه الألياف) مفتوحة المصدر المستندة إلى MATLAB³⁰ لقياس زاوية اتجاه ألياف الكولاجين الفردية الموجودة في البلاط. استخدم المعلمات التالية: المقاييس: [3 4 5] أو [2 4 6] ، اعتمادا على قطر الوعاء ، وعتبة السفينة: 0.999 أو 0.9995 أو 0.9999 ، اعتمادا على شدة إشارة SHG.
  ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام هذه الأداة في دليل البرنامج³¹.
3. استخدم أداة أخرى مفتوحة المصدر تستند إلى MATLAB ، FibLab³² ، لتناسب توزيع Gaussian مع الرسم البياني لتوزيع الزاوية.
  ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام هذه الأداة في دليل البرنامج³².
4. من مخطط التوزيع الغاوسي الذي تم الحصول عليه باستخدام FibLab ، استخرج المعلمات الهيكلية التالية من مساحة عمل MATLAB: زاوية الألياف السائدة (μ p) ، وهي طريقة التوزيع ، والانحراف المعياري (σ_p) لتوزيع زاوية الألياف ، والكسر متباين الخواص (P_ani = 1 -_{P iso}).
  ملاحظة: الكسر الخواص هو المنطقة الواقعة تحت خط الأساس في التوزيع الغاوسي، في حين أن الكسر متباين الخواص يحتوي على مساحة القمة فوق خط الأساس³³. يوفر كل من_{σ p} و P_ani معلومات حول تشتت اتجاه الألياف في منطقة البلاط.
5. للفحص البصري ، ارسم μ p باستخدام الخطوط الموجهة و σ_p و P_aniباستخدام الخرائط الملونة.
تحليل الصور الرقمية وتحليل التمزق
1. قم بإجراء فحص بصري على صور الكاميرا لتحديد الإطار الذي يحدث فيه بدء التمزق. في هذا الإطار ، حدد بصريا موقع التمزق.
2. قم بإجراء فحص بصري على صور الكاميرا لتحديد أي صدع أو تمزق في نهاية المطاف في موقع التمزق في بداية الاختبار الميكانيكي. في حالة وجود مثل هذا المسيل للدموع ، استبعد العينة من التحليل.
3. قم بإجراء تحليل DIC باستخدام البرنامج مفتوح المصدر المستند إلى MATLAB Ncorr (v1.2) ³⁴. اتبع الخطوات الواردة في دليل Ncorr³⁵.
  1. استخدم صور الكاميرا المسجلة أثناء اختبار الشد باستخدام الكاميرا عالية السرعة لمدينة دبي للإنترنت. حدد الإطار الأخير قبل التمدد النهائي حتى الفشل (بعد التهيئة المسبقة) كصورة مرجعية. للصور الحالية، حدد كل الصور من بداية التمدد النهائي حتى الإطار الأخير قبل الإطار الذي حدث فيه بدء التمزق.
  2. حدد سطح العينة كمنطقة الاهتمام (ROI). استبعد المناطق القريبة (حوالي 1 مم) من المشابك ، حيث ستتأثر السلالات في هذه المناطق بشدة بالمقابض.
  3. إجراء تحليل مدينة دبي للإنترنت باستخدام المعلمات التالية: نصف قطر المجموعة الفرعية: 30 بكسل ؛ تباعد المجموعة الفرعية: ثلاثة بكسل ؛ قطع التكرار: 50 ؛ معيار قطع متجه الفرق: 10-5 ؛ نصف قطر السلالة: 5 ؛ الانتشار التلقائي ، الخطوة #: 5.
  4. من تحليل DIC مع Ncorr ، احصل على توزيعات Green-Lagrange (أو سلالة Eulerian) لعائد الاستثمار. استخدم توزيعات الإجهاد هذه لحساب متوسط سلالة جرين لاغرانج لسطح عينة البلاك بالكامل في الإطار الأخير قبل التمزق. احسب سلالة جرين لاغرانج في موقع التمزق.
ربط البيانات الهيكلية والميكانيكية في موقع التمزق
1. باستخدام المعالم الطبيعية في عينة الاختبار والبقع المطبقة على عينة الاختبار ، حدد موقع التمزق (المحدد في الخطوة 4.2.1) على الصورة المرجعية (الخطوة 4.2.3.1).
2. باستخدام المعالم الطبيعية في عينة الاختبار، قم بعمل تراكب للصورة المرجعية ومسح التجانب (الخطوة 2.3) لتحديد موقع التمزق في مسح التجانب. حدد بلاط MPM-SHG حيث حدث التمزق. إذا لم يكن التمزق في بلاطة تم مسحها ضوئيا باستخدام MPM-SHG ، فحدد البلاط الأقرب إلى موقع التمزق. الحصول على المعلمات الهيكلية الموجودة في البلاط حيث حدث التمزق.

Representative Results

جمع الأنسجة وإعداد عينة الاختبار
ينتج عن جمع الأنسجة عينات الأنسجة الليفية اللويحية التي يمكن تشريحها إلى عينات اختبار فردية للتصوير الهيكلي واختبار الشد أحادي المحور. من الناحية المثالية ، تحتوي عينة الأنسجة الليفية التي تم جمعها على مناطق بها تمزقات قليلة أو معدومة (الشكل 5 أ) وتكلسات كبيرة (الشكل 5 ب). قد يؤدي وجود فائض من هذه التمزقات والتكلسات (الشكل 5C) إلى عينات من البلاك لا تفي بمتطلبات أبعاد العينة المذكورة سابقا في WL 1.

التصوير المجهري متعدد الفوتونات
يوفر تصوير SHG والمعالجة اللاحقة للصور MIPs من كل بلاطة مصورة (الشكل 6A ، B). ينتج عن المعالجة اللاحقة الإضافية عن طريق الكشف عن الألياف (الشكل 6C) مخططات تكرارية لاتجاه الألياف (الشكل 6 د) يمكن من خلالها استخراج المعلمات الهيكلية للكولاجين (الشكل 6E). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على خرائط ملونة توضح معلمات الكولاجين الهيكلية المحلية عبر عينة البلاك بأكملها للتحليل البصري (الشكل 6F ، G). بالنسبة لعينة الاختبار التمثيلية في الشكل 6 ، تم العثور على تباين كبير داخل العينة في معلمات الكولاجين الهيكلية (متوسط ± SD من μ p = -34 درجة ± 32 درجة ؛ σ_p = 21 درجة ± 4 درجة ؛ P_ani = 0.49 ± 0.14 ، إذا تم تعريف الاتجاه المحيطي على أنه 0 درجة). يؤكد هذا الاختلاف داخل العينة على أهمية الحصول على المعلمات الهيكلية المحلية بدلا من افتراض التجانس.

الاختبارات الميكانيكية
سلوك التمزق
توفر الكاميرا عالية السرعة صورا لسلوك التشوه والتمزق لعينات البلاك أثناء الاختبار الميكانيكي (الشكل 7). من هذه الصور ، يمكن تحديد موقع بدء التمزق ومسار انتشار التمزق. تكون نتائج تحديد التمزق دون المستوى الأمثل إذا كانت الفقاعات أو الانعكاسات موجودة في صور الكاميرا ، أو إذا كان التمزق ينتشر بسرعة كبيرة بحيث لا يمكن التقاطه بمعدل الإطارات المختار.

أنماط السلالة المحلية
يوفر تحليل ارتباط الصورة الرقمية على تسجيلات الكاميرا التي تم الحصول عليها أثناء اختبار الشد أحادي المحور خرائط تشوه الأنسجة المحلية ، مثل خرائط سلالة جرين لاغرانج الموضحة في الشكل 8. تعرض هذه الخرائط مكونات الإجهاد الثلاثة (ε_xx و ε_xy و ε_yy) في الإطار قبل بدء التمزق. من خرائط الإجهاد هذه ، يمكن استخراج متوسط السلالات في منطقة الاهتمام والإجهاد المحلي في بقعة ما ، مثل موقع التمزق.

بالنسبة للعينة التمثيلية في الشكل 8 ، تظهر بيانات السلالة المحلية تباينا كبيرا داخل العينة. بالنسبة لعينة الاختبار التمثيلية في الشكل 8 ، تم العثور على تباين كبير داخل العينة في السلالات المحلية (نطاقات السلالات المرصودة هي كما يلي: ε_xx = -0.30-0.17 ؛ ε_xy = -0.13-0,20 ؛ ε_yy = 0-0.40). هذا يؤكد على أهمية الحصول على البيانات المحلية بدلا من القيم الإجمالية والمتوسط التي تم الحصول عليها بافتراض تجانس الأنسجة.

ربط معلومات الأنسجة الميكانيكية والهيكلية
تسمح النتائج المذكورة أعلاه بربط سلوك التشوه والتمزق الموضعي للأنسجة ببنية الكولاجين. بمجرد تحديد موقع التمزق في تسجيلات الكاميرا (الشكل 9 أ) ، يمكن تعيينه مرة أخرى إلى صورة الكاميرا المرجعية (الشكل 9 ب) وإلى مسح بلاط الفحص المجهري (الشكل 9 ج). يوفر هذا بلاط MPM-SHG حيث حدث التمزق والمعلمات الهيكلية الموجودة في هذا البلاط (الشكل 9D). المعلمات الهيكلية الموجودة في البلاط حيث حدث تمزق في عينة تمثيلية ، كما هو موضح في الشكل 9 ، هي_μ p = 28 درجة ، σ_p = 19 درجة ، و P_ani = 0.6. يمكن أيضا تطبيق نفس الإجراء على مواقع الأنسجة غير الممزقة. من المهم ملاحظة أن تعيين موقع التمزق على الصورة المرجعية من إطار التمزق قد يكون صعبا في حالة وجود نمط بقع ضعيف ومعالم طبيعية غير واضحة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت المعالم الطبيعية للأنسجة غير واضحة بما فيه الكفاية ، فقد يكون التسجيل المشترك لتراكب مسح البلاط وصور الكاميرا عالية السرعة أمرا صعبا.

الشكل 1: مخطط سير العمل للبروتوكول التجريبي المقدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: اختيار البلاطات لتصوير SHG من مسح البلاط . (أ) عينة اختبار مثبتة في السيليكون. (ب) مسح البلاط لعينة الاختبار التي تم الحصول عليها بواسطة مجهر برايتفيلد. يتم تمييز المربعات المحددة لتصوير SHG بمربعات زرقاء. (ج) الإسقاط الأقصى لكثافة MPM مع SHG. شريط المقياس = 140 ميكرومتر (C). الاختصارات: SHG = الجيل التوافقي الثاني ؛ MPM = المجهر متعدد الفوتونات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: عينة لوحة موضوعة تحت هدف المجهر متعدد الفوتونات. يتم تأمين موقع عينة البلاك بواسطة طبق بتري مملوء بالفوسفات مملوء بالمحلول الملحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: جهاز اختبار الشد أحادي المحور المصمم خصيصا مع مكوناته المختلفة المشار إليها . (أ) نظرة عامة شاملة على النظام. لاحظ أن إدخالات ورق الصنفرة في المشابك مرئية حيث يتم توصيل المشابك السفلية فقط. (B) صورة مكبرة لمشابك جهاز اختبار الشد مع عينة الاختبار جاهزة للاختبار. الاختصارات: PVC = كلوريد البوليفينيل. LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: نتائج جمع الأنسجة وتحضير العينات من العينات التمثيلية . (أ) عينة جديدة وسليمة من اللويحات ، تم استردادها من المرضى الذين خضعوا لجراحة استئصال باطنة الشريان السباتي. (ب) إعادة بناء 3D من فحص μCT. تظهر الأنسجة المتكلسة باللون الأزرق الفاتح وغير المتكلسة باللون الأحمر. يمكن الحصول على عينة مثالية بدون أنسجة متكلسة من المنطقة الواقعة بين الخطوط الزرقاء. (C) إعادة بناء 3D من مسح μCT يظهر لوحة دون المستوى الأمثل مع وجود فائض من الأنسجة المتكلسة. شريط المقياس = 3 مم. الاختصار: μCT = التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: نتائج MPM-SHG من عينة تمثيلية. (أ) نظرة عامة على مسح البلاط؛ تظهر اللوحات المحددة للتصوير باللون الأزرق. (ب) MIPs من بلاط مختلف. (ج) الكشف عن الألياف بواسطة أداة FOA من بلاط محدد (# 1). (د) الرسم البياني لاتجاه الألياف من بلاطة محددة. (ه) الرسم البياني لاتجاه الألياف + ملاءمة غاوسية ، والتي يمكن من خلالها استخلاص المعلمات الهيكلية للكولاجين من بلاطة محددة. (F) تمثيل μ_p (الخط الأسود الاتجاهي) و σ_p (لون الخلفية) عبر عينة اللوحة بأكملها. (G) تمثيل μ_p (الخط الأسود الاتجاهي) و P_ani (لون الخلفية) عبر عينة اللوحة بأكملها. قضبان المقياس = 140 ميكرومتر (B ، C). الاختصارات: MPM-SHG = المجهر متعدد الفوتونات - الجيل الثاني التوافقي ؛ MIPs = توقعات الكثافة القصوى ؛ FOA = تحليل اتجاه الألياف ؛ μ_p= زاوية الألياف السائدة ؛ P_ani= جزء متباين الخواص ؛ σ_p= الانحراف المعياري لتوزيع زاوية الألياف ؛ P_iso = جزء الخواص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: بدء التمزق وانتشاره في عينة أنسجة البلاك أثناء إجراء اختبار الشد.1) حالة التمدد المسبق ، الأنسجة السليمة. 2) تمزق بدء الإطار الأول الذي لوحظ تمزق. يتم تمييز موقع بدء التمزق بمربع أحمر. 3 ) و 4) انتشار التمزق. 5) تمزق كامل لعينة البلاك. قضبان المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: أنماط سلالة جرين-لاغرانج لعينة تمثيلية (ε_xx و ε_xy و ε_yy) في الإطار قبل التمزق ، تم الحصول عليها باستخدام تحليل مدينة دبي للإنترنت. يتم إعطاء متوسط وانحراف معياري على اللوحة بأكملها ، جنبا إلى جنب مع الإجهاد في موقع التمزق. الاختصارات: DIC = ارتباط الصورة الرقمية ؛ ε_xx = إجهاد طولي ؛ ε_xy = القص ؛ ε_yy= إجهاد الشد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: صورة تراكب لموقع التمزق (المربع الأحمر) على الصور. (أ) صورة كاميرا عالية السرعة، حيث يتم تحديد التمزق (إطار التمزق). (B) صورة كاميرا عالية السرعة، حيث يتم تطبيق التمدد المسبق فقط (الإطار المرجعي). (ج) صورة مسح البلاط التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري. (د) خريطة مرمزة بالألوان توضح المعلمات التركيبية للكولاجين المحلي في مربعات مختلفة. يتم عرض μ_p (الخط الأسود الاتجاهي) و P_ani (لون الخلفية) عبر عينة اللوحة بأكملها. الاختصارات: μ_p= زاوية الألياف السائدة ؛ P_ani= جزء متباين الخواص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ركزت الدراسة الحالية على تطوير خط أنابيب التصوير الميكانيكي لدراسة العلاقة بين اتجاه الكولاجين المحلي والتشتت ، والخصائص الميكانيكية المحلية ، وسلوك تمزق أنسجة اللويحات تصلب الشرايين الليفية. البروتوكول الموصوف هنا مبتكر لعدة أسباب. أولا ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تطبيق ارتباط الصورة الرقمية لقياس التشوه المحلي لأنسجة البلاك الليفي تحت التحميل الميكانيكي. ثانيا ، يوفر هذا البروتوكول المعلومات اللازمة لتحليل العلاقة بين نمط التشوه الموضعي وبنية الكولاجين المحلية لأنسجة البلاك الليفية. يتم التأكيد على أهمية التقييم المحلي من خلال كل من بيانات السلالة وبيانات الكولاجين المقدمة في قسم النتائج ، والتي تظهر الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة. لذلك ، يوصى باستخدام التقنيات التي تمكن من التقييم المحلي ، مثل تلك المستخدمة في هذا البروتوكول ، للدراسات المستقبلية لخصائص البلاك الليفي.

يعد تحضير عينة الاختبار من بين الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول. لويحات الشريان السباتي هي أساسا أنسجة الكولاجين. ومع ذلك ، قد تحتوي على تكلسات تعتبر أنها تؤثر على السلوك الميكانيكي العام للوحة^36,37. نظرا لأن الدراسة تركز على مكون الأنسجة الليفية في اللويحة ، يتم تجنب التكلسات في عينات الاختبار باستخدام التصوير المقطعي المحوسب³⁸. في حالة عدم توفر μCT ، يمكن النظر في تقنيات التصوير الأخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو OCT³⁹ للكشف عن المناطق المتكلسة في اللويحة. قد يكون الحصول على عينات اختبار الأنسجة الليفية الخالية من التكلسات وذات الحجم الكبير بما يكفي والتي يمكن تطبيقها للاختبار الميكانيكي مهمة صعبة بالنسبة للويحات المتكلسة بشدة أو التي تحتوي على تكلسات مشتتة. مهمة أخرى صعبة في البروتوكول هي توليد نمط بقع مثالي لارتباط الصورة الرقمية. تتطلب مدينة دبي للإنترنت المثلى نسبة أبيض وأسود تبلغ 50:50²⁸ وبقع بحجم ثلاثة إلى خمسة بكسل²⁹ لضمان الجودة المناسبة. قد يؤدي الفشل في تلبية هذه المتطلبات إلى قياسات سلالة محلية غير دقيقة. أخيرا ، قد يكون تعيين موقع التمزق لصور SHG أمرا صعبا إذا كانت المعالم الطبيعية للأنسجة غير واضحة. بالنسبة لمثل هذه العينات ، سيكون تطبيق العديد من العلامات الإيمانية على الأنسجة قبل التصوير مفيدا.

تتفوق تقنية MPM-SHG المستخدمة في البروتوكول الحالي على العديد من تقنيات تصوير الكولاجين الأخرى ، حيث إنها تقنية عالية الدقة وغير مدمرة مع عمق اختراق كبير نسبيا. ومع ذلك ، فإن عمق الاختراق (<400 ميكرومتر) ل MPM-SHG يشكل قيدا ، لأنه لا يسمح بتصوير السماكة الكاملة لعينات الاختبار ، والتي تراوحت بين 0.5 و 2 مم. في دراسة حديثة مع التصوير بالرنين المغناطيسي لموتر الانتشار (DT-MRI) ، أثبتنا أن اتجاه الألياف السائد في الأجزاء العميقة من نسيج البلاك يمكن أن يكون مختلفا عن ذلك الموجود في الأجزاء السطحية واللمعية من الأنسجة¹⁴. لذلك ، هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات للتحقيق في بنية الكولاجين المحلية في الأجزاء العميقة من عينات أنسجة البلاك الليفي السميك وعلاقتها بميكانيكا الأنسجة المحلية. ولهذا الغرض، يمكن استخدام تصوير مجال التردد المكاني المستقطب (pSFDI). تم الإبلاغ عن أن تقنية التصوير البصري التي تم تطويرها مؤخرا لديها القدرة على قياس اتجاه الألياف بعمق يصل إلى 0.8 مم في وريقات الصمام التاجي¹². يوفر pSFDI أيضا عملية اكتساب سريعة ، والتي يمكن أن تسهل أيضا تصور منطقة العينة بأكملها بدلا من مجموعة مختارة من البلاط فقط ، كما هو الحال في البروتوكول الحالي. ومن القيود الأخرى للبروتوكول الحالي أنه لا يمكن تحديد سوى تشوه السطح. في الدراسات المستقبلية ، يمكن تضمين DIC⁴⁰ متعدد الرؤية بمساعدة المرآة أو ارتباط الحجم الرقمي (DVC)⁴¹ في هذا البروتوكول للحصول على معلومات إضافية عن السلالات الحجمية تحت السطحية.

يمكن توسيع البروتوكول التجريبي الحالي أو تعديله بعدة طرق للحصول على معلومات إضافية حول ميكانيكا تمزق البلاك وعلاقتها بالبنية المجهرية الأساسية. أولا ، يتضمن البروتوكول الحالي اختبار الشد أحادي المحور في الاتجاه المحيطي. تم اختيار هذا النوع من الاختبارات الميكانيكية لأن اللويحة تعاني في الغالب من تمدد الشد في الاتجاه المحيطي في الجسم الحي. للحصول على توصيف ميكانيكي أكثر شمولا ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل اختبار التضخم أو الاختبار ثنائي المحور أو اختبار الشد أحادي المحور في الاتجاه الطولي. ثانيا، يركز البروتوكول الحالي فقط على الحصول على السلالات المحلية من خلال مدينة دبي للإنترنت. ومع ذلك ، يمكن الحصول على رؤية أكثر اكتمالا للسلوك الميكانيكي للوحة من خلال تضمين تحليل الإجهاد المحلي في البروتوكول ، ولكن هذا يتطلب توصيف الصلابة المحلية. على الرغم من التحدي الحالي ، يمكن تحقيق ذلك من خلال التقنيات الحسابية مثل طريقة العناصر المحدودة العكسية ^42,43 وطريقة الحقول الافتراضية⁴⁴. بصرف النظر عن التكيف التجريبي ، يمكن أيضا إضافة بعض خطوات المعالجة اللاحقة الإضافية إلى البروتوكول الحالي. أولا ، بدلا من تحديد موقع التمزق فقط ، يمكن تحديد مسار انتشار الكراك عبر صور الكاميرا عالية السرعة التي تم الحصول عليها. يمكن ربط مسار الانتشار هذا بالمعلمات الهيكلية والميكانيكية المحلية. ثانيا ، تم تحديد موقع بدء التمزق بصريا في البروتوكول الموصوف. استخدمت دراسة سابقة على الأنسجة غير البيولوجية الانقطاعات في قياسات سلالة مدينة دبي للإنترنت للكشف عن التمزق⁴⁵. يمكن أن يؤدي تطبيق مثل هذا الكشف الآلي عن التمزق على أنسجة البلاك إلى تحسين دقة اكتشاف التمزق. أخيرا ، من المزايا الرائعة ل MPM-SHG مقارنة بتقنيات تصوير الكولاجين الأخرى أنه يصور ألياف الكولاجين الفردية. لذلك ، يمكن أيضا استخدام البيانات التي تم الحصول عليها عبر هذا البروتوكول للتحقيق في خصائص الكولاجين المحلية الإضافية ، مثل محتوى الكولاجين.

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوفير فهم أفضل للخصائص المحلية لأنسجة البلاك الليفية ، وهو المكون الذي يفشل ميكانيكيا في تمزق البلاك في الجسم الحي. هذه المعلومات ضرورية لإنشاء علامات تصوير هيكلية ووظيفية جديدة تتنبأ بتمزق البلاك لدى المرضى. هذه العلامات الجديدة ضرورية ، حيث ثبت أن المؤشرات الحيوية للمخاطر المقترحة سابقا لها قيمة تنبؤية دون المستوى الأمثل للأحداث السريرية المستقبلية ^5,6. في المستقبل ، يمكن ل OCT و ps-OCT تحديد وقياس الأنسجة الليفية في الجهاز الشرياني⁴⁶،⁴⁷^،⁴⁸. بالإضافة إلى ذلك ، تم اعتبار الإجهاد علامة بديلة لتكوين اللوحة المحلية⁴⁹. وبالتالي ، يمكن أن تساعد قياسات الإجهاد في الجسم الحي ⁴⁹ في تحديد استقرار البلاك لدى المرضى. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يكون حذرا في ترجمة النتائج التي تم الحصول عليها مباشرة إلى تمزق البلاك في الجسم الحي. أولا ، يتعرض نسيج اللويحات الليفي لتحميل أكثر تعقيدا في الجسم الحي من تحميل الشد أحادي الاتجاه المستخدم في هذا البروتوكول. ثانيا ، لويحات تصلب الشرايين هي هياكل متعددة المكونات. يمكن أن تتأثر توزيعات الإجهاد والإجهاد في الجسم الحي في أنسجة اللويحات الليفية بوجود وموقع مكونات البلاك الأخرى ، مثل التكلسات³⁷.

يمكن أيضا استخدام خط أنابيب التصوير الميكانيكي هذا لدراسة أنسجة الكولاجين الأخرى. تستخدم الاختبارات الميكانيكية العالمية والتصوير الهيكلي للكولاجين بالفعل على نطاق واسع للأنسجة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن التقييم المحلي لخصائص ما قبل الفشل والفشل ، وكذلك بنية الكولاجين ، أمر بالغ الأهمية للتوصيف الميكانيكي الدقيق للأنسجة الليفية غير المتجانسة. نتوقع أن يوفر هيكل هذا البروتوكول الجديد مزيدا من التبصر في التفاعل بين البنية المجهرية وميكانيكا العديد من الأنسجة البيولوجية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة NWO-Vidi (18360).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm extension ring	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL tube	VWR	525-0150
20x APO water immersion objective	Leica	507701
3D Slicer software	N/A	Version 4.11
50 mL tubes	VWR	525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating	Thorlabs
Black tissue dye	Polysciences inc	24113-2
Camera lens, focal length 50 mm	Thorlabs Inc.	MVL50M1
Camera stand	VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser	Coherent
Compressor + air hose	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm	Pattex
Heating bath	N/A		Custom made
High-speed camera + imaging software	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery)	N/A
Image J	National Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	Version 2.3	Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II	Leica		Microscope used for SHG imaging
Lighting system	AMZ instruments	LED-60TB	Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB	MathWorks	Version R2021A
MATLAB-based FibLab software	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based Ncorr software	Georgia Institute of Technology	Version 1.2
Needles	Emerald	BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
Pasteur Pipettes	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
Sandpaper (P180)	Conrad	4.00932E+12
Side cutter	Conrad	4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tensile tester + software + clamps	N/A		Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver	Garant, Hoffman group	659906

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Bioengineering

طريقة لدراسة العلاقة بين بنية الكولاجين المحلي والخواص الميكانيكية للأنسجة الليفية اللويحية تصلب الشرايين

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.