हमने विषम संरचनात्मक और यांत्रिक एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका गुणों का अध्ययन करने के लिए एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित की है। यह पाइपलाइन कोलेजन फाइबर अभिविन्यास के स्थानीय प्रमुख कोण और फैलाव, टूटने के व्यवहार और रेशेदार पट्टिका ऊतक के तनाव फिंगरप्रिंट के सहसंबंध को सक्षम करती है।
कोरोनरी और कैरोटिड धमनियों में एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े का टूटना घातक कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं का प्राथमिक कारण है। हालांकि, विषम, अत्यधिक कोलेजनस पट्टिका ऊतक के टूटना यांत्रिकी, और यह ऊतक की रेशेदार संरचना से कैसे संबंधित है, अभी तक ज्ञात नहीं है। पट्टिका यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए मौजूदा पाइपलाइनें ऊतक की संरचनात्मक समरूपता की धारणा के आधार पर पट्टिका ऊतक की केवल सकल यांत्रिक विशेषताओं को प्राप्त करने तक सीमित हैं। हालांकि, रेशेदार पट्टिका ऊतक संरचनात्मक रूप से विषम है, यकीनन मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर आर्किटेक्चर में स्थानीय भिन्नता के कारण।
यहां वर्णित मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विषम संरचनात्मक और यांत्रिक पट्टिका गुणों का अध्ययन करने के लिए विकसित की गई है। इस पाइपलाइन में, ऊतक के स्थानीय कोलेजन आर्किटेक्चर को दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) के साथ मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) का उपयोग करके विशेषता है, और ऊतक की विफलता व्यवहार को डिजिटल छवि सहसंबंध (डीआईसी) विश्लेषण का उपयोग करके एकअक्षीय तन्यता परीक्षण स्थितियों के तहत विशेषता है। यह प्रयोगात्मक पाइपलाइन कोलेजन फाइबर अभिविन्यास के स्थानीय प्रमुख कोण और फैलाव, टूटने के व्यवहार और रेशेदार पट्टिका ऊतक के तनाव फिंगरप्रिंट के सहसंबंध को सक्षम करती है। प्राप्त ज्ञान एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने की घटनाओं को बेहतर ढंग से समझने, भविष्यवाणी करने और रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
इस्केमिक स्ट्रोक, अक्सर कैरोटिड धमनियों में एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने से शुरू होता है, दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता के प्रमुख कारणों में से एक है। हालांकि, कैरोटिड एथेरोस्क्लेरोसिस से संबंधित स्ट्रोक को रोकने के लिए वर्तमान सर्जिकल उपचार योजना रणनीतियों में पट्टिका टूटना जोखिम मूल्यांकन2 शामिल नहीं है। यह मुख्य रूप से है क्योंकि पहले सुझाए गए जोखिम बायोमार्कर, जैसे कि प्लेक कैप मोटाई3 और लिपिड कोर आकार4, को भविष्य की नैदानिक घटनाओं 5,6 के लिए उप-पूर्वानुमानित मूल्य दिखाया गया है। पट्टिका टूटना जोखिम मूल्यांकन को अनुकूलित करने और एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े के नए जोखिम मार्करों की पहचान करने के लिए पट्टिका यांत्रिकी और टूटना तंत्र की बेहतर समझ आवश्यक है।
पट्टिका टूटना एक स्थानीय यांत्रिक घटना है जहां अत्यधिक रेशेदार पट्टिका ऊतक रक्तचाप द्वारा उस पर लगाए गए यांत्रिक लोडिंग का सामना करने में विफल रहता है और अपनी संरचनात्मक अखंडता खोदेता है। इसके बावजूद, पट्टिका टूटने की घटना के यांत्रिकी और अंतर्निहित माइक्रोस्ट्रक्चर से इसके लिंक को खराबतरीके से समझा जाता है। पट्टिका ऊतक विफलता की विशेषता वाले कुछ प्रयोगात्मक अध्ययनों में 9,10,11,12,13 सकल यांत्रिक टूटना गुण (यानी, अंतिम तन्यता विफलता तनाव और ताकत) की सूचना दी गई, जो ऊतक की संरचनात्मक एकरूपता की धारणा के साथ प्राप्त हुई। हालांकि, रेशेदार पट्टिका ऊतक संरचनात्मक रूप से विषम है, यकीनन मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर आर्किटेक्चर14 में स्थानीय भिन्नता के कारण। इसके अलावा, पट्टिका ऊतक यांत्रिक विफलता विशेषताओं और कोलेजन वास्तुकला के बीच की कड़ी की जांच केवल जॉनसन एट अल द्वारा हाल के एक अध्ययन में की गई थी। लेखकों ने प्रमुख फाइबर अभिविन्यास में एक अंतर दिखाया और मुख्य रूप से परिधीय फाइबर अभिविन्यास 15 के साथ रेशेदार पट्टिका टोपी नमूनों के लिए उच्च अंतिम तनाव और कम अंतिमउपभेदों की सूचना दी। हालांकि, अध्ययन सकल यांत्रिक और संरचनात्मक गुणों तक भी सीमित था।
स्थानीय कोलेजन वास्तुकला और रेशेदार पट्टिका ऊतक के स्थानीय यांत्रिक गुणों के बारे में आवश्यक जानकारी पर प्रकाश डालने के लिए, वर्तमान अध्ययन में, हमने एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित की है। यह पूर्व विवो पाइपलाइन स्थानीय कोलेजन फाइबर दिशा और फैलाव, साथ ही स्थानीय टूटना तनाव की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाती है। पाइपलाइन में पट्टिका ऊतक में कोलेजन फाइबर की छवि बनाने के लिए एसएचजी के साथ एमपीएम इमेजिंग शामिल है, साथ ही ऊतक की टूटने की विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए डीआईसी और एकअक्षीय तन्यता परीक्षण भी शामिल है।
मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी-सेकंड-हार्मोनिक पीढ़ी (एमपीएम-एसएचजी) जैविकऊतकों में कोलेजन का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है। अन्य कोलेजन इमेजिंग तकनीकों की तुलना में तकनीक के कई फायदे हैं, जैसे कि हिस्टोलॉजी17, प्रसार टेंसर इमेजिंग (डीटीआई)14, और छोटे कोण प्रकाश प्रकीर्णन (एसएएलएस)15। सबसे पहले, एमपीएम-एसएचजी इमेजिंग गैर-विनाशकारी है, जो यांत्रिक परीक्षण18 के साथ गठबंधन करने के लिए आदर्श बनाता है। दूसरा, एसएचजी सिग्नल कोलेजन के लिए विशिष्ट है, और इसलिए ऊतक का कोई धुंधलापन आवश्यक नहीं है। लंबी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (निकट-अवरक्त) के कारण, प्रवेश गहराई अन्य माइक्रोस्कोपीतकनीकों की तुलना में अधिक है। एसएचजी इमेजिंग के साथ प्राप्त उच्च रिज़ॉल्यूशन (एसएम-स्तर) व्यक्तिगत फाइबर के विज़ुअलाइज़ेशन की भी अनुमति देता है। यह कई संभावनाएं प्रदान करता है, जैसे कोलेजन फाइबर की संख्या का स्थानीय परिमाणीकरण, कोलेजन फाइबर अभिविन्यास और वितरण19।
यांत्रिक परीक्षण के साथ संयुक्त डिजिटल छवि सहसंबंध (डीआईसी) जैविकऊतकों के स्थानीय यांत्रिक गुणों को प्राप्त करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। डीआईसी के साथ, ऊतक की सतह पर लागू झुकाव के विस्थापन को यांत्रिक परीक्षण20 के दौरान प्राप्त उच्च गति वाले कैमरा छवियों की तुलना करके ट्रैक किया जाता है। इस छवि पोस्टप्रोसेसिंग विधि का उपयोग नमूना20 के पूर्ण-क्षेत्र सतह उपभेदों का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है और इसका उपयोग ऊतक21 के टूटने के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन ने स्थानीय कोलेजन अभिविन्यास और फैलाव, स्थानीय यांत्रिक गुणों और रेशेदार एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका ऊतक के टूटने के व्यवहार के बीच सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कई कारणों से अभिनव है। सबसे पहले, यह पहली बार है कि यांत्रिक लोडिंग के तहत रेशेदार पट्टिका ऊतक के स्थानीय विरूपण को मापने के लिए डिजिटल छवि सहसंबंध लागू किया गया है। दूसरा, यह प्रोटोकॉल स्थानीय विरूपण पैटर्न और रेशेदार पट्टिका ऊतक के स्थानीय कोलेजन वास्तुकला के बीच संबंध का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है। परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत तनाव डेटा और कोलेजन डेटा दोनों द्वारा स्थानीय मूल्यांकन के महत्व पर जोर दिया जाता है, जो ऊतक की विषम प्रकृति को दर्शाता है। इसलिए, स्थानीय मूल्यांकन को सक्षम करने वाली तकनीकों का उपयोग, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले, रेशेदार पट्टिका गुणों के भविष्य के अध्ययन के लिए अनुशंसित हैं।
परीक्षण नमूना तैयारी इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। कैरोटिड सजीले टुकड़े मुख्य रूप से कोलेजनस ऊतक हैं; हालांकि, उनमें कैल्सीफिकेशन हो सकते हैं जिन्हें समग्र पट्टिका यांत्रिक व्यवहार36,37 को प्रभावित करने के लिए माना जाता है। जैसा कि अध्ययन पट्टिका के रेशेदार ऊतक घटक पर केंद्रित है,38 का उपयोग करके परीक्षण नमूनों में कैल्सीफिकेशन से बचा जाता है। यदि μCT उपलब्ध नहीं है, तो पट्टिका में कैल्सीफाइड क्षेत्रों का पता लगाने के लिए एमआरआई या OCT39 जैसी अन्य इमेजिंग तकनीकों पर विचार किया जा सकता है। रेशेदार ऊतक परीक्षण नमूने प्राप्त करना जो कैल्सीफिकेशन से मुक्त हैं और एक बड़े आकार के हैं जो यांत्रिक परीक्षण के लिए काम करने योग्य हैं, सजीले टुकड़े के लिए एक चुनौतीपूर्ण कार्य हो सकता है जो भारी कैल्सीफाइड होते हैं या छितरी हुई कैल्सीफिकेशन होते हैं। प्रोटोकॉल में एक और चुनौतीपूर्ण कार्य डिजिटल छवि सहसंबंध के लिए एक इष्टतम झुकाव पैटर्न उत्पन्न कर रहा है। इष्टतम डीआईसी को 50: 5028 के काले / सफेद अनुपात की आवश्यकता होती है और उचित गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए तीन से पांच पिक्सेल29 के आकार को दर्शाता है। इन आवश्यकताओं को पूरा करने में विफलता के परिणामस्वरूप गलत स्थानीय तनाव माप हो सकते हैं। अंत में, एसएचजी छवियों के टूटने के स्थान का मानचित्रण चुनौतीपूर्ण हो सकता है यदि ऊतक के प्राकृतिक स्थल स्पष्ट नहीं हैं। ऐसे नमूनों के लिए, इमेजिंग से पहले ऊतक के लिए कई फिड्यूशियल मार्करों का अनुप्रयोग सहायक होगा।
वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली एमपीएम-एसएचजी तकनीक कई अन्य कोलेजन इमेजिंग तकनीकों से बेहतर है, क्योंकि यह अपेक्षाकृत बड़ी प्रवेश गहराई के साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन और गैर-विनाशकारी तकनीक है। फिर भी, एमपीएम-एसएचजी की प्रवेश गहराई (<400 μm) एक सीमा बनाती है, क्योंकि यह परीक्षण नमूनों की पूरी मोटाई की इमेजिंग की अनुमति नहीं देती है, जो 0.5 और 2 मिमी के बीच थी। प्रसार टेन्सर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (डीटी-एमआरआई) के साथ एक हालिया अध्ययन में, हमने दिखाया है कि पट्टिका ऊतक के गहरे हिस्सों में प्रमुख फाइबर अभिविन्यास ऊतक14 के अधिक सतही, ल्यूमिनल भागों में से एक से अलग हो सकता है। इसलिए, मोटी रेशेदार पट्टिका ऊतक नमूनों के गहरे हिस्सों में स्थानीय कोलेजन वास्तुकला और स्थानीय ऊतक यांत्रिकी के साथ इसके संबंध की जांच करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस उद्देश्य के लिए, ध्रुवीकृत स्थानिक आवृत्ति डोमेन इमेजिंग (पीएसएफडीआई) का उपयोग किया जा सकता है। इस हाल ही में विकसित ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक में माइट्रल वाल्व पत्रक12 में 0.8 मिमी तक फाइबर अभिविन्यास को मापने की क्षमता बताई गई थी। पीएसएफडीआई एक तेजी से अधिग्रहण भी प्रदान करता है, जो केवल टाइलों के चयन के बजाय पूरे नमूना क्षेत्र के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा भी प्रदान कर सकता है, जैसा कि वर्तमान प्रोटोकॉल में होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि केवल सतह विरूपण की पहचान की जा सकती है। भविष्य के अध्ययनों में, मिरर-असिस्टेड मल्टी-व्यू डीआईसी40 या डिजिटल वॉल्यूम सहसंबंध (डीवीसी) 41 को वॉल्यूमेट्रिक, उपसतह उपभेदों पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है।
वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को पट्टिका टूटना यांत्रिकी और अंतर्निहित माइक्रोस्ट्रक्चर के संबंध के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए कई तरीकों से आगे बढ़ाया या संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, वर्तमान प्रोटोकॉल में परिधीय दिशा में एकअक्षीय तन्यता परीक्षण शामिल है। इस प्रकार के यांत्रिक परीक्षण को चुना गया था क्योंकि पट्टिका मुख्य रूप से विवो में परिधीय दिशा में तन्यता खिंचाव का अनुभव करती है। अधिक व्यापक यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए, इस प्रोटोकॉल को अनुदैर्ध्य दिशा में मुद्रास्फीति परीक्षण, द्विअक्षीय परीक्षण, या एकअक्षीय तन्यता परीक्षण को शामिल करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है। दूसरा, वर्तमान प्रोटोकॉल केवल डीआईसी के माध्यम से स्थानीय उपभेदों को प्राप्त करने पर केंद्रित है। हालांकि, प्रोटोकॉल में स्थानीय तनाव विश्लेषण को शामिल करके पट्टिका यांत्रिक व्यवहार का अधिक पूर्ण दृश्य प्राप्त किया जा सकता है, फिर भी इसके लिए स्थानीय कठोरता के लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है। हालांकि वर्तमान में चुनौतीपूर्ण है, यह कम्प्यूटेशनल तकनीकों जैसे व्युत्क्रम परिमित तत्व विधि42,43 और आभासी फ़ील्ड विधि 44 द्वारा प्राप्त किया जा सकताहै। प्रयोगात्मक अनुकूलन के अलावा, कुछ अतिरिक्त पोस्टप्रोसेसिंग चरणों को भी वर्तमान प्रोटोकॉल में जोड़ा जा सकता है। सबसे पहले, केवल टूटने के स्थान की पहचान करने के बजाय, प्राप्त उच्च गति कैमरा छवियों के माध्यम से दरार-प्रसार पथ की पहचान की जा सकती है। इस प्रसार पथ को स्थानीय संरचनात्मक और यांत्रिक मापदंडों से सहसंबद्ध किया जा सकता है। दूसरा, वर्णित प्रोटोकॉल में टूटना दीक्षा स्थान को नेत्रहीन रूप से पहचाना गया था। गैर-जैविक ऊतकों पर एक पिछले अध्ययन ने टूटने का पता लगाने के लिए डीआईसी तनाव माप में अंतर का उपयोग कियाहै। पट्टिका ऊतकों पर इस तरह के स्वचालित टूटने का पता लगाने को लागू करने से संभवतः टूटने का पता लगाने की सटीकता में सुधार हो सकता है। अंत में, अन्य कोलेजन इमेजिंग तकनीकों की तुलना में एमपीएम-एसएचजी का एक बड़ा लाभ यह है कि यह व्यक्तिगत कोलेजन फाइबर की कल्पना करता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त डेटा का उपयोग अतिरिक्त स्थानीय कोलेजन विशेषताओं, जैसे कोलेजन सामग्री की जांच के लिए भी किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग रेशेदार पट्टिका ऊतक की स्थानीय विशेषताओं की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए किया जा सकता है, वह घटक जो विवो में पट्टिका टूटने में यांत्रिक रूप से विफल रहता है। इस जानकारी को नए संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग मार्करों को स्थापित करने की आवश्यकता है जो रोगियों में पट्टिका टूटने की भविष्यवाणी करते हैं। ये नए मार्कर आवश्यक हैं, क्योंकि पहले सुझाए गए जोखिम बायोमाकर्स को भविष्य की नैदानिक घटनाओं के लिए उप-पूर्वानुमानित मूल्य दिखाया गया है। भविष्य में, ओसीटी और पीएस-ओसीटी संभवतः धमनी प्रणाली46,47,48 में रेशेदार ऊतक की पहचान और मात्रा निर्धारित कर सकते हैं। इसके अलावा, तनाव को स्थानीय पट्टिका संरचना49 के लिए एक सरोगेट मार्कर माना जाता था। इस प्रकार, विवो स्ट्रेन मापमें 49 संभावित रूप से रोगियों में पट्टिका स्थिरता की पहचान में सहायता कर सकता है। हालांकि, प्राप्त परिणामों को सीधे विवो पट्टिका टूटने में अनुवाद करने से सावधान रहना चाहिए। सबसे पहले, रेशेदार पट्टिका ऊतक इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले यूनिडायरेक्शनल तन्यता लोडिंग की तुलना में विवो में अधिक जटिल लोडिंग का अनुभव करता है। दूसरा, एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े बहुघटक संरचनाएं हैं; रेशेदार पट्टिका ऊतक में विवो तनाव और तनाव वितरण अन्य पट्टिका घटकों की उपस्थिति और स्थान से प्रभावित हो सकता है, जैसे कि कैल्सीफिकेशन37।
इस मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन का उपयोग अन्य कोलेजनस ऊतकों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। कोलेजन के वैश्विक यांत्रिक परीक्षण और संरचनात्मक इमेजिंग पहले से ही जैविक ऊतकों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, पूर्व-विफलता और विफलता गुणों के साथ-साथ कोलेजन वास्तुकला का स्थानीय मूल्यांकन, विषम रेशेदार ऊतकों के सटीक यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है। हम उम्मीद करते हैं कि इस नए प्रोटोकॉल की संरचना कई जैविक ऊतकों के माइक्रोस्ट्रक्चर और यांत्रिकी के बीच परस्पर क्रिया में और अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनडब्ल्यूओ-विडी अनुदान (18360) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
Excel | Microsoft | Version 2208 | |
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
Heating bath | N/A | Custom made | |
High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
Image J | National Institute of Health | N/A | |
LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
Needles | Emerald | BDAM302986 | |
Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |