Vi har utviklet en mekano-avbildningsrørledning for å studere de heterogene strukturelle og mekaniske aterosklerotiske plakkegenskapene. Denne rørledningen muliggjør korrelasjon av den lokale dominerende vinkelen og spredningen av kollagenfiberorientering, bruddoppførselen og belastningsfingeravtrykkene til det fibrøse plakkvevet.
Brudd på aterosklerotiske plakk i koronar- og karoten arterier er den primære årsaken til dødelige kardiovaskulære hendelser. Imidlertid er bruddmekanikken til det heterogene, svært kollagenøse plakkvevet, og hvordan dette er relatert til vevets fibrøse struktur, ikke kjent ennå. Eksisterende rørledninger for å studere plakkmekanikk er begrenset til å oppnå bare brutto mekaniske egenskaper av plakkvevet, basert på antagelsen om strukturell homogenitet av vevet. Imidlertid er fibrøst plakkvev strukturelt heterogent, uten tvil hovedsakelig på grunn av lokal variasjon i kollagenfiberarkitekturen.
Mekano-avbildningsrørledningen beskrevet her er utviklet for å studere de heterogene strukturelle og mekaniske plakkegenskapene. I denne rørledningen karakteriseres vevets lokale kollagenarkitektur ved hjelp av multifotonmikroskopi (MPM) med andre harmoniske generasjon (SHG), og vevets feiloppførsel karakteriseres under uniaxiale strekkprøvingsbetingelser ved bruk av digital bildekorrelasjon (DIC) analyse. Denne eksperimentelle rørledningen muliggjør korrelasjon av den lokale dominerende vinkelen og spredningen av kollagenfiberorientering, bruddoppførselen og belastningsfingeravtrykkene til det fibrøse plakkvevet. Den oppnådde kunnskapen er nøkkelen til bedre å forstå, forutsi og forhindre aterosklerotiske plakkbruddhendelser.
Iskemisk hjerneslag, ofte utløst av aterosklerotisk plakkruptur i halspulsårer, er en av de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet over hele verden1. Imidlertid inkluderer de nåværende kirurgiske behandlingsplanleggingsstrategiene for å forhindre ateroskleroserelatert hjerneslag ikke risikovurdering av plakkruptur2. Dette skyldes hovedsakelig at de tidligere foreslåtte risikobiomarkørene, som plakkhettetykkelse3 og lipidkjernestørrelse4, har vist seg å ha suboptimal prediktiv verdi for fremtidige kliniske hendelser 5,6. En bedre forståelse av plakkmekanikk og bruddmekanismer er nødvendig for å optimalisere risikovurdering av plakkbrudd og identifisere nye risikomarkører for aterosklerotiske plakk.
Plakkbrudd er en lokal mekanisk hendelse der det svært fibrøse plakkvevet ikke tåler den mekaniske belastningen som utøves på det av blodtrykket og mister sin strukturelle integritet7. Til tross for dette er mekanikken til plakkbruddhendelsen og dens kobling til den underliggende mikrostrukturen dårlig forstått8. De få eksperimentelle studiene som karakteriserte plakkvevssvikt har 9,10,11,12,13 rapporterte brutto mekaniske rupturegenskaper (dvs. ultimate strekksviktbelastning og styrke), avledet med antagelsen om strukturell homogenitet av vevet. Imidlertid er det fibrøse plakkvevet strukturelt heterogent, uten tvil hovedsakelig på grunn av lokal variasjon i kollagenfiberarkitekturen14. Videre ble koblingen mellom plakkvevets mekaniske sviktegenskaper og kollagenarkitekturen bare undersøkt i en nylig studie av Johnston et al. Forfatterne viste en interplakkforskjell i den dominerende fiberorienteringen og rapporterte høyere ultimate spenninger og lavere ultimate belastninger for fibrøse plakkhetteprøver med en overveiende omkretsfiberorientering15. Studien var imidlertid også begrenset til brutto mekaniske og strukturelle egenskaper.
For å belyse viktig informasjon om den lokale kollagenarkitekturen og lokale mekaniske egenskaper til det fibrøse plakkvevet, har vi i den nåværende studien utviklet en mekano-avbildningsrørledning. Denne ex vivo-rørledningen muliggjør kvantifisering av den lokale kollagenfiberretningen og dispersjonen, samt lokal bruddstamme. Rørledningen involverer MPM-avbildning med SHG for å avbilde kollagenfibre i plakkvevet, samt DIC- og uniaxial strekkprøving for å kvantifisere vevets bruddegenskaper.
Multifotonmikroskopi-andreharmonisk generasjon (MPM-SHG) har blitt en populær teknikk for å studere kollagen i biologisk vev16. Teknikken har mange fordeler sammenlignet med andre kollagenavbildningsteknikker, for eksempel histologi17, diffusjonstensoravbildning (DTI)14 og småvinklet lysspredning (SALS)15. For det første er MPM-SHG-avbildning ikke-destruktiv, noe som gjør den ideell å kombinere med mekanisk testing18. For det andre er SHG-signalet spesifikt for kollagen, og derfor er det ikke nødvendig med farging av vevet. På grunn av de lange eksitasjonsbølgelengdene (nær-infrarød) er penetrasjonsdybden større enn med andre mikroskopiteknikker16. Den høye oppløsningen (μm-nivået) oppnådd med SHG-avbildning tillater også visualisering av individuelle fibre. Dette gir mange muligheter, for eksempel lokal kvantifisering av antall kollagenfibre, kollagenfiberorientering og distribusjon19.
Digital bildekorrelasjon (DIC) kombinert med mekanisk testing er en mye brukt metode for å oppnå lokale mekaniske egenskaper til biologisk vev20. Med DIC spores forskyvningen av flekker påført på vevsoverflaten ved å sammenligne høyhastighetskamerabilder tatt under mekanisk testing20. Denne bildepostprosesseringsmetoden brukes til å estimere fullfeltoverflatestammene til prøven20 og kan også brukes til å studere bruddoppførselen til vevet21.
Den nåværende studien fokuserte på å utvikle en mekano-imaging rørledning for å studere sammenhengen mellom lokal kollagenorientering og dispersjon, lokale mekaniske egenskaper og bruddoppførsel av fibrøst aterosklerotisk plakkvev. Protokollen beskrevet her er nyskapende av flere grunner. For det første er dette første gang digital bildekorrelasjon har blitt brukt til å måle lokal deformasjon av fibrøst plakkvev under mekanisk belastning. For det andre gir denne protokollen den nødvendige informasjonen for å analysere sammenhengen mellom det lokale deformasjonsmønsteret og den lokale kollagenarkitekturen i det fibrøse plakkvevet. Betydningen av den lokale vurderingen understrekes av både tøyningsdataene og kollagendataene som presenteres i resultatdelen, som viser vevets heterogene natur. Derfor anbefales bruk av teknikker som muliggjør lokal vurdering, slik som de som brukes i denne protokollen, for fremtidige studier av fibrøse plakkegenskaper.
Forberedelse av testprøver er blant de kritiske trinnene i denne protokollen. Caroteplakk er hovedsakelig kollagenøst vev; Imidlertid kan de inneholde forkalkninger som anses å påvirke den generelle plakkmekaniske oppførselen36,37. Siden studien fokuserer på den fibrøse vevskomponenten i plakket, unngås forkalkninger i testprøvene ved å bruke μCT-avbildning38. Hvis μCT ikke er tilgjengelig, kan andre bildebehandlingsteknikker som MR eller OCT39 vurderes for å oppdage de forkalkede områdene i plakket. Innhenting av fibrøse vevsprøver som er fri for forkalkninger og er av stor nok størrelse som kan brukes til mekanisk testing, kan være en utfordrende oppgave for plakk som er tungt forkalket eller inneholder dispergerte forkalkninger. En annen utfordrende oppgave i protokollen er å generere et optimalt flekkmønster for digital bildekorrelasjon. Optimal DIC krever et svart/hvitt-forhold på 50:5028 og flekker størrelsen på tre til fem piksler29 for å sikre riktig kvalitet. Unnlatelse av å oppfylle disse kravene kan føre til unøyaktige lokale belastningsmålinger. Til slutt kan det være utfordrende å kartlegge bruddplasseringen til SHG-bildene hvis de naturlige landemerkene til et vev ikke er klare. For slike prøver vil påføring av flere fiducialmarkører på vevet før avbildning være nyttig.
MPM-SHG-teknikken som brukes i den nåværende protokollen er overlegen mange andre kollagenavbildningsteknikker, da det er en høyoppløselig og ikke-destruktiv teknikk med relativt stor penetrasjonsdybde. Likevel utgjør penetrasjonsdybden (<400 μm) til MPM-SHG en begrensning, da den ikke tillater avbildning av hele tykkelsen på testprøvene, som varierte mellom 0,5 og 2 mm. I en nylig studie med diffusjonstensor magnetisk resonansavbildning (DT-MR) har vi vist at den dominerende fiberorienteringen i de dypere delene av plakkvevet kan være forskjellig fra den i de mer overfladiske, luminale delene av vevet14. Derfor er videre studier berettiget til å undersøke den lokale kollagenarkitekturen i de dypere delene av tykke fibrøse plakkvevsprøver og dens forhold til den lokale vevsmekanikken. Til dette formål kan polarisert romlig frekvensdomeneavbildning (pSFDI) benyttes. Denne nylig utviklede optiske bildebehandlingsteknikken ble rapportert å ha potensial til å måle fiberorientering så dypt som 0,8 mm i mitralventilbrosjyrer12. pSFDI tilbyr også en rask anskaffelse, som også kan lette visualisering av hele prøveområdet i stedet for bare et utvalg fliser, slik tilfellet er i den nåværende protokollen. En annen begrensning ved gjeldende protokoll er at bare overflatedeformasjon kunne identifiseres. I fremtidige studier kan speilassistert multi-view DIC40 eller digital volumkorrelasjon (DVC)41 inkluderes i denne protokollen for å få ytterligere informasjon om volumetriske stammer i undergrunnen.
Den nåværende eksperimentelle protokollen kan utvides eller modifiseres ytterligere på flere måter for å få ytterligere informasjon om plakkbruddmekanikk og dens forhold til den underliggende mikrostrukturen. For det første inkluderer den nåværende protokollen uniaxial strekkprøving i omkretsretningen. Denne typen mekanisk testing ble valgt siden plakket hovedsakelig opplever strekkstrekk i omkretsretningen in vivo. For mer omfattende mekanisk karakterisering kan denne protokollen utvides ytterligere til å omfatte inflasjonstesting, biaksial testing eller uniaxial strekkprøving i lengderetningen. For det andre fokuserer den nåværende protokollen bare på å skaffe lokale stammer gjennom DIC. Imidlertid kan en mer fullstendig oversikt over plakkets mekaniske oppførsel oppnås ved også å inkludere lokal spenningsanalyse i protokollen, men dette krever karakterisering av lokal stivhet. Selv om det for tiden er utfordrende, kan dette oppnås ved beregningsteknikker som den inverse endelige elementmetoden 42,43 og den virtuelle feltmetoden44. Bortsett fra eksperimentell tilpasning, kan noen ekstra etterbehandlingstrinn også legges til den nåværende protokollen. For det første, i stedet for bare å identifisere bruddstedet, kan sprekkutbredelsesbanen identifiseres via de oppnådde høyhastighetskamerabildene. Denne forplantningsbanen kan korreleres med lokale strukturelle og mekaniske parametere. For det andre ble bruddinitieringsstedet visuelt identifisert i den beskrevne protokollen. En tidligere studie på ikke-biologiske vev har brukt diskontinuiteter i DIC-stammemålinger for å oppdage brudd45. Bruk av slik automatisert brudddeteksjon på plakkvev kan muligens forbedre nøyaktigheten av brudddeteksjonen. Endelig er en stor fordel med MPM-SHG sammenlignet med andre kollagenavbildningsteknikker at den visualiserer individuelle kollagenfibre. Derfor kan dataene oppnådd via denne protokollen også brukes til å undersøke ytterligere lokale kollagenegenskaper, for eksempel kollageninnholdet.
Denne protokollen kan brukes til å gi en bedre forståelse av de lokale egenskapene til fibrøst plakkvev, komponenten som mekanisk svikter ved plakkbrudd in vivo. Denne informasjonen er nødvendig for å etablere nye strukturelle og funksjonelle bildemarkører som forutsier plakkbrudd hos pasienter. Disse nye markørene er nødvendige, siden de tidligere foreslåtte risikobiomarkørene har vist seg å ha suboptimal prediktiv verdi for fremtidige kliniske hendelser 5,6. I fremtiden kan OCT og ps-OCT muligens identifisere og kvantifisere fibrøst vev i arteriesystemet46,47,48. I tillegg ble stamme ansett som en surrogatmarkør for lokal plakksammensetning49. In vivo belastningsmålinger49 kan derfor potensielt hjelpe til med å identifisere plakkstabilitet hos pasienter. Imidlertid bør man være forsiktig med direkte å oversette de oppnådde resultatene til in vivo plakkruptur. For det første opplever det fibrøse plakkvevet mer kompleks belastning in vivo enn den ensrettede strekkbelastningen som brukes i denne protokollen. For det andre er aterosklerotiske plakk multikomponentstrukturer; In vivo spennings- og tøyningsfordelingene i det fibrøse plakkvevet kan påvirkes av tilstedeværelsen og lokalisasjonen av de andre plakkkomponentene, slik som forkalkninger37.
Denne mekano-imaging rørledningen kan også brukes til å studere andre kollagenøse vev. Global mekanisk testing og strukturell avbildning av kollagen er allerede mye brukt for biologiske vev. Imidlertid er lokal vurdering av pre-svikt og sviktegenskaper, samt kollagenarkitektur, avgjørende for nøyaktig mekanisk karakterisering av heterogene fibrøse vev. Vi forventer at strukturen i denne nye protokollen vil gi ytterligere innsikt i samspillet mellom mikrostruktur og mekanikk i flere biologiske vev.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av et NWO-Vidi-stipend (18360).
10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
Excel | Microsoft | Version 2208 | |
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
Heating bath | N/A | Custom made | |
High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
Image J | National Institute of Health | N/A | |
LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
Needles | Emerald | BDAM302986 | |
Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |