Vi har utvecklat en pipeline för mekanoavbildning för att studera heterogena strukturella och mekaniska aterosklerotiska plackegenskaper. Denna pipeline möjliggör korrelation mellan den lokala dominerande vinkeln och dispersionen av kollagenfiberorientering, bristningsbeteendet och belastningsfingeravtrycken i den fibrösa plackvävnaden.
Brottet av aterosklerotiska plack i kranskärl och halspulsåder är den främsta orsaken till dödliga kardiovaskulära händelser. Bristningsmekaniken hos den heterogena, mycket kollagenösa plackvävnaden, och hur detta är relaterat till vävnadens fibrösa struktur, är dock ännu inte kända. Befintliga rörledningar för att studera plackmekanik är begränsade till att endast erhålla grovmekaniska egenskaper hos plackvävnaden, baserat på antagandet om vävnadens strukturella homogenitet. Fibrös plackvävnad är emellertid strukturellt heterogen, förmodligen främst på grund av lokal variation i kollagenfiberarkitekturen.
Den mekano-avbildande rörledningen som beskrivs här har utvecklats för att studera de heterogena strukturella och mekaniska plackegenskaperna. I denna pipeline karakteriseras vävnadens lokala kollagenarkitektur med användning av multifotonmikroskopi (MPM) med andra harmoniska generationen (SHG), och vävnadens sviktbeteende karakteriseras under enaxliga dragprovningsförhållanden med hjälp av digital bildkorrelation (DIC) analys. Denna experimentella pipeline möjliggör korrelation mellan den lokala dominerande vinkeln och dispersionen av kollagenfiberorientering, bristningsbeteendet och stamfingeravtrycken hos den fibrösa plackvävnaden. Den erhållna kunskapen är nyckeln till att bättre förstå, förutsäga och förhindra aterosklerotiska plackbrott.
Ischemisk stroke, ofta utlöst av aterosklerotisk plackbrott i halspulsådern, är en av de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet över hela världen1. De nuvarande kirurgiska dosplaneringsstrategierna för att förhindra carotid aterosklerosrelaterad stroke inkluderar emellertid inte riskbedömning av plackbrott2. Detta beror främst på att de tidigare föreslagna riskbiomarkörerna, såsom plaque cap tjocklek3 och lipidkärnstorlek4, har visat sig ha suboptimalt prediktivt värde för framtida kliniska händelser 5,6. En bättre förståelse av plackmekanik och rupturmekanismer är nödvändig för att optimera riskbedömning av plackbrott och identifiera nya riskmarkörer för aterosklerotiska plack.
Plackbrott är en lokal mekanisk händelse där den mycket fibrösa plackvävnaden inte tål den mekaniska belastning som blodtrycket utövar på den och förlorar sin strukturella integritet7. Trots detta är mekaniken för plackbrottet och dess länk till den underliggande mikrostrukturen dåligt förstådd8. De få experimentella studier som karakteriserade plackvävnadssvikt har 9,10,11,12,13 rapporterade grova mekaniska brottegenskaper (dvs. ultimat dragsviktstöjning och styrka), härledd med antagandet om vävnadens strukturella homogenitet. Den fibrösa plackvävnaden är emellertid strukturellt heterogen, förmodligen främst på grund av lokal variation i kollagenfiberarkitekturen14. Dessutom undersöktes kopplingen mellan plackvävnadens mekaniska felegenskaper och kollagenarkitekturen endast i en nyligen genomförd studie av Johnston et al. Författarna visade en interplaque skillnad i den dominerande fiberorienteringen och rapporterade högre ultimata spänningar och lägre ultimata stammar för fibrösa placklockprover med en övervägande omkretsfiberorientering 15. Studien var emellertid också begränsad till grova mekaniska och strukturella egenskaper.
För att belysa den väsentliga informationen om den lokala kollagenarkitekturen och lokala mekaniska egenskaper hos den fibrösa plackvävnaden har vi i den aktuella studien utvecklat en pipeline för mekanoavbildning. Denna ex vivo-pipeline möjliggör kvantifiering av den lokala kollagenfiberriktningen och dispersionen, såväl som lokal bristningsstam. Rörledningen innefattar MPM-avbildning med SHG för att avbilda kollagenfibrer i plackvävnaden, samt DIC och enaxlig dragprovning för att kvantifiera vävnadens bristningsegenskaper.
Multifotonmikroskopi-andra-harmonisk generation (MPM-SHG) har blivit en populär teknik för att studera kollagen i biologiska vävnader16. Tekniken har många fördelar jämfört med andra kollagenavbildningstekniker, såsom histologi17, diffusionstensoravbildning (DTI)14 och ljusspridning med liten vinkel (SALS)15. För det första är MPM-SHG-avbildning icke-förstörande, vilket gör den idealisk att kombinera med mekanisk testning18. För det andra är SHG-signalen specifik för kollagen, och därför är ingen färgning av vävnaden nödvändig. På grund av de långa excitationsvåglängderna (nära infraröd) är penetrationsdjupet större än med andra mikroskopitekniker16. Den höga upplösningen (μm-nivå) som uppnås med SHG-avbildning möjliggör också visualisering av enskilda fibrer. Detta erbjuder många möjligheter, såsom lokal kvantifiering av antalet kollagenfibrer, kollagenfiberorientering och distribution19.
Digital bildkorrelation (DIC) i kombination med mekanisk testning är en allmänt använd metod för att erhålla lokala mekaniska egenskaper hos biologiska vävnader20. Med DIC spåras förskjutningen av fläckar som appliceras på vävnadsytan genom att jämföra höghastighetskamerabilder som förvärvats under mekanisk testning20. Denna bildbehandlingsmetod används för att uppskatta ytstammarna i hela fältet för provet20 och kan också användas för att studera bristningsbeteendet hos vävnaden21.
Den aktuella studien fokuserade på att utveckla en pipeline för mekano-avbildning för att studera korrelationen mellan den lokala kollagenorienteringen och dispersionen, lokala mekaniska egenskaper och bristningsbeteende hos fibrös aterosklerotisk plackvävnad. Protokollet som beskrivs här är innovativt av flera skäl. För det första är detta första gången som digital bildkorrelation har tillämpats för att mäta den lokala deformationen av fibrös plackvävnad under mekanisk belastning. För det andra tillhandahåller detta protokoll nödvändig information för att analysera sambandet mellan det lokala deformationsmönstret och den lokala kollagenarkitekturen hos den fibrösa plackvävnaden. Betydelsen av den lokala bedömningen betonas av både stamdata och kollagendata som presenteras i resultatavsnittet, som visar vävnadens heterogena natur. Därför rekommenderas användning av tekniker som möjliggör lokal bedömning, såsom de som används i detta protokoll, för framtida studier av fibrösa plackegenskaper.
Testprovberedning är bland de kritiska stegen i detta protokoll. Carotisplack är huvudsakligen kollagenvävnader; De kan dock innehålla förkalkningar som anses påverka det övergripande plackmekaniska beteendet36,37. Eftersom studien fokuserar på den fibrösa vävnadskomponenten i placket undviks förkalkningar i testproverna med hjälp av μCT-avbildning38. Om μCT inte är tillgängligt kan andra avbildningstekniker såsom MRT eller OCT39 övervägas för att detektera de förkalkade områdena i placket. Att erhålla fibrösa vävnadstestprover som är fria från förkalkningar och är av tillräckligt stor storlek som är användbara för mekanisk testning kan vara en utmanande uppgift för plack som är kraftigt förkalkade eller innehåller dispergerade förkalkningar. En annan utmanande uppgift i protokollet är att generera ett optimalt fläckmönster för digital bildkorrelation. Optimal DIC kräver ett svart/vitt förhållande på 50:5028 och fläckar storleken på tre till fem pixlar29 för att säkerställa lämplig kvalitet. Underlåtenhet att uppfylla dessa krav kan leda till felaktiga lokala töjningsmätningar. Slutligen kan kartläggning av bristningsplatsen till SHG-bilderna vara utmanande om de naturliga landmärkena i en vävnad inte är tydliga. För sådana prover kommer applicering av flera fiduciella markörer på vävnaden före avbildning att vara till hjälp.
MPM-SHG-tekniken som används i det nuvarande protokollet är överlägsen många andra kollagenavbildningstekniker, eftersom det är en högupplöst och icke-destruktiv teknik med ett relativt stort penetrationsdjup. Ändå utgör penetrationsdjupet (<400 μm) för MPM-SHG en begränsning, eftersom det inte tillåter avbildning av hela tjockleken på testproverna, som varierade mellan 0,5 och 2 mm. I en nyligen genomförd studie med diffusionstensor magnetisk resonanstomografi (DT-MRI) har vi visat att den dominerande fiberorienteringen i de djupare delarna av plackvävnaden kan skilja sig från den i de mer ytliga, luminala delarna av vävnaden14. Därför är ytterligare studier motiverade för att undersöka den lokala kollagenarkitekturen i de djupare delarna av tjocka fibrösa plackvävnadsprover och dess relation till den lokala vävnadsmekaniken. För detta ändamål kan polariserad rumslig frekvensdomänavbildning (pSFDI) användas. Denna nyligen utvecklade optiska bildteknik rapporterades ha potential att mäta fiberorientering så djupt som 0,8 mm i mitralisklaffblad12. pSFDI erbjuder också en snabb förvärv, vilket också kan underlätta visualisering av hela provområdet istället för bara ett urval av brickor, vilket är fallet i det nuvarande protokollet. En annan begränsning i det nuvarande protokollet är att endast ytdeformation kunde identifieras. I framtida studier kan spegelassisterad multi-view DIC40 eller digital volymkorrelation (DVC)41 inkluderas i detta protokoll för att få ytterligare information om de volymetriska, underjordiska stammarna.
Det nuvarande experimentella protokollet kan utvidgas ytterligare eller modifieras på flera sätt för att få ytterligare information om plackbrottmekanik och dess relation till den underliggande mikrostrukturen. För det första innehåller det nuvarande protokollet enaxlig dragprovning i omkretsriktningen. Denna typ av mekanisk testning valdes eftersom placket övervägande upplever dragsträckning i omkretsriktningen in vivo. För mer omfattande mekanisk karakterisering kan detta protokoll utökas ytterligare för att inkludera inflationstestning, biaxial testning eller enaxlig dragprovning i längdriktningen. För det andra fokuserar det nuvarande protokollet endast på att erhålla lokala stammar genom DIC. En mer fullständig bild av det plackmekaniska beteendet kan dock erhållas genom att även inkludera lokal stressanalys i protokollet, men detta kräver karakterisering av lokal styvhet. Även om det för närvarande är utmanande kan detta uppnås med beräkningstekniker som den inversa finita elementmetoden 42,43 och den virtuella fältmetoden44. Förutom experimentell anpassning kan vissa ytterligare efterbehandlingssteg också läggas till i det nuvarande protokollet. För det första, istället för att bara identifiera brottets plats, kan sprickutbredningsvägen identifieras via de erhållna höghastighetskamerabilderna. Denna förökningsväg kan korreleras med lokala strukturella och mekaniska parametrar. För det andra identifierades brottets initieringsplats visuellt i det beskrivna protokollet. En tidigare studie på icke-biologiska vävnader har använt diskontinuiteter i DIC-stammätningar för att upptäcka bristning45. Att tillämpa sådan automatiserad brottdetektering på plackvävnader kan möjligen förbättra noggrannheten i brottdetekteringen. Slutligen är en stor fördel med MPM-SHG jämfört med andra kollagenavbildningstekniker att det visualiserar enskilda kollagenfibrer. Därför kan data som erhållits via detta protokoll också användas för att undersöka ytterligare lokala kollagenegenskaper, såsom kollageninnehållet.
Detta protokoll kan användas för att ge en bättre förståelse för de lokala egenskaperna hos fibrös plackvävnad, den komponent som mekaniskt misslyckas vid plackbrott in vivo. Denna information behövs för att etablera nya strukturella och funktionella bildmarkörer som förutsäger plackbrott hos patienter. Dessa nya markörer är nödvändiga, eftersom de tidigare föreslagna riskbiomarkörerna har visat sig ha suboptimalt prediktivt värde för framtida kliniska händelser 5,6. I framtiden kan OCT och ps-OCT möjligen identifiera och kvantifiera fibrös vävnad i artärsystemet46,47,48. Dessutom betraktades stam som en surrogatmarkör för lokal placksammansättning49. Således kan stammätningar in vivo 49 potentiellt hjälpa till att identifiera plackstabilitet hos patienter. Man bör dock vara försiktig med att direkt översätta de erhållna resultaten till in vivo plackbrott. För det första upplever den fibrösa plackvävnaden mer komplex belastning in vivo än den enkelriktade dragbelastningen som används i detta protokoll. För det andra är aterosklerotiska plack multikomponentstrukturer; Spännings- och töjningsfördelningarna in vivo i den fibrösa plackvävnaden kan påverkas av närvaron och placeringen av de andra plackkomponenterna, såsom förkalkningar37.
Denna mekano-imaging pipeline kan också användas för att studera andra kollagena vävnader. Global mekanisk testning och strukturell avbildning av kollagen används redan i stor utsträckning för biologiska vävnader. Lokal bedömning av pre-failure och felegenskaper, liksom kollagenarkitektur, är dock avgörande för noggrann mekanisk karakterisering av heterogena fibrösa vävnader. Vi förväntar oss att strukturen i detta nya protokoll kommer att ge ytterligare insikt i samspelet mellan mikrostrukturen och mekaniken hos flera biologiska vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av ett NWO-Vidi-bidrag (18360).
10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
Excel | Microsoft | Version 2208 | |
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
Heating bath | N/A | Custom made | |
High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
Image J | National Institute of Health | N/A | |
LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
Needles | Emerald | BDAM302986 | |
Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |