Pyrosekventering assays muliggør robust og hurtig genotypning af mitokondrie-DNA enkeltnukleotidpolymorfier i heteroplasmatiske celler eller væv.
Mutationer i mitokondriegenomet (mtDNA) har været forbundet med moderens arvelige genetiske sygdomme. Imidlertid er interessen for mtDNA-polymorfier steget i de senere år på grund af den nyligt udviklede evne til at producere modeller ved mtDNA-mutagenese og en ny forståelse af sammenhængen mellem mitokondrie genetiske aberrationer og almindelige aldersrelaterede sygdomme som kræft, diabetes og demens. Pyrosequencing er en sekventerings-for-syntese teknik, der er bredt anvendt på tværs af mitokondriefeltet til rutinemæssige genotypeforsøg. Dens relative overkommelighed sammenlignet med massive parallelle sekventeringsmetoder og nem implementering gør det til en uvurderlig teknik inden for mitokondriegenetik, hvilket giver mulighed for hurtig kvantificering af heteroplasmi med øget fleksibilitet. På trods af den praktiske anvendelse af denne metode kræver dens implementering som et middel til mtDNA-genotypning overholdelse af visse retningslinjer, specifikt for at undgå visse forstyrrelser af biologisk eller teknisk oprindelse. Denne protokol skitserer de nødvendige trin og forholdsregler ved design og implementering af pyrosekventering assays til brug i forbindelse med heteroplasmi måling.
Mitokondriegenomet findes i form af små (16,5 kb) cirkulære molekyler (mtDNA), der er til stede i mitokondriernes inderste rum ved navn matrixen og koder for 13 underenheder af mitokondrie-respirationskæden samt de tRNA’er og rRNA’er, der er nødvendige for deres oversættelse in situ af mitokondrieribosomet1. Dette genom repræsenterer ca. 1% af alle de proteiner, der er nødvendige for mitokondriefunktionen, hvoraf resten er kodet af det nukleare DNA (nDNA). Det antages almindeligvis, at mitokondrier stammer fra en endosymbiotisk fusionsbegivenhed mellem en alfa-proteobakteriel forfader og en forfædres eukaryot celle. Når denne hypotetiske symbiose fandt sted, blev mitokondriernes genetiske information gradvist overført til kernen over æoner, hvilket forklarer den førnævnte kompakthed af mtDNA sammenlignet med genomerne af moderne cyanobakterier2. En sådan overførsel af gener er stærkest bevist ved eksistensen af lange strækninger af nDNA, der er meget homologe med sekvenserne fundet i mtDNA. Disse nukleare mitokondriesekvenser (NUMT’er) er en almindelig kilde til fejlfortolkning under genotypning, og der skal træffes visse forholdsregler for at undgå nukleare forstyrrelser ved genotypning af mtDNA3 (figur 1A).
Et andet særpræg ved mtDNA er, at dets kopinummer varierer afhængigt af celletypen, der nummererer alt fra titusinder til tusinder af kopier pr.Celle 4. På grund af denne multikopi-natur kan mtDNA rumme en bred vifte af genotyper inden for en enkelt celle, hvilket kan resultere i en mere kontinuerlig fordeling af alleler i modsætning til de diskrete alleler forbundet med nukleare gener, når man overvejer kromosomernes zygositet. Denne heterogenitet af mitokondriealleler kaldes mitokondriel heteroplasmi, som typisk udtrykkes i procentprævalensen af en given mutation som en andel af det samlede mtDNA i en given celle. Heteroplasmi kan kontrasteres med homoplasmi, som refererer til en unik art af mtDNA, der er til stede på tværs af en celle.
Måling af mitokondriel heteroplasmi er af særlig interesse ved kvantificering af andelen af mtDNA-molekyler, der huser patogene varianter. Sådanne varianter kommer i form af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP’er), små indels eller store deletioner5. De fleste mennesker er heteroplasmatiske for patogene varianter; De udviser imidlertid ingen kliniske fænotyper, som ofte kun manifesterer sig ved højere heteroplasmatiske niveauer af patogent mtDNA i et fænomen, der kaldes tærskeleffekten6. Mens værdierne forbundet med patogenicitet er stærkt afhængige af arten af den patogene mutation og vævet, hvori den forekommer, ligger de typisk over 60% heteroplasmi7.
Der er flere forskningsområder, hvor mitokondriel genotypebestemmelse er almindelig. På det medicinske område kan testning for eller kvantificering af mtDNA-mutationer tjene som et diagnostisk kriterium for mitokondriesygdomme, hvoraf mange har mtDNA-aberrationer som deres oprindelse5. Ud over undersøgelsen af humane patogene mutationer vil forekomsten af dyremodeller, der huser patogene SNP’er i mtDNA’et, sandsynligvis stige i betragtning af den nylige fremkomst af mitokondriebaseredigering muliggjort af mitokondrielt målrettede DddA-afledte cytosinbaseeditorer (DdCBE’er)8 og TALE-baserede deaminaser (TALED’er) til adeninbaseredigering9. Denne tilgang vil være medvirkende til at forstå samspillet mellem afvigende mitokondriegenotyper og de deraf følgende dysfunktioner. Der er også igangværende videnskabelig forskning i ombygning af mitokondriegenomet til ultimativ anvendelse som en terapeutisk strategi i humane mitokondriesygdomme via en tilgang kendt som heteroplasmi shifting. Dette forskningsfelt involverer primært at dirigere mutationsspecifikke nukleaser til mitokondriematrixen; dette resulterer i den præferentielle nedbrydning af patogent mtDNA, hvilket fører til redning i fænotype10,11,12,13. Ethvert eksperiment, der involverer ombygning af mitokondriegenotypen, kræver en robust kvantitativ metode til vurdering af heteroplasmiskift.
En lang række metoder bruges til at genotype mtDNA, og disse varierer alt efter mutationens art. Næste generations sekventeringsmetoder (NGS) er mere præcise, når det kommer til kvantificering af SNP’er i mtDNA; Disse metoder forbliver imidlertid uoverkommeligt dyre til rutinemæssig kvantificering af mitokondriel heteroplasmi, især hvis antallet af prøver er lille. Sanger-sekventering kan også give mulighed for detektion af SNP’er; Denne tilgang er imidlertid ikke kvantitativ og undlader ofte at detektere lave niveauer af heteroplasmi eller kan være unøjagtig, når man estimerer høje heteroplasmier. Pyrosekventering som et assay, der involverer minimal forberedelse og muliggør hurtig kvantificering af heteroplasmi for enhver mtDNA-prøve, foreslås som et passende kompromis mellem disse to ekstremer. Denne metode er blevet brugt rutinemæssigt til at kvantificere mitokondrie SNP’er af adskillige forskere i forskellige sammenhænge, herunder retsmedicinsk analyse 14,15, klinisk diagnose16 eller genotypning af mtDNA fra enkeltceller17.
Dette assay involverer et første PCR-præamplifikationstrin i en region, der flankerer SNP i mtDNA’et, som efterfølges af et sekventerings-for-syntese-assay ved anvendelse af en streng af den tidligere genererede amplicon. En af de to primere, der anvendes i præamplifikationstrinnet, skal biotinyleres på 5′-enden, hvilket gør det muligt for pyrosekventering at isolere den enkelte DNA-streng, der skal bruges som skabelon for sekventeringsreaktionen. En tredje sekventeringsprimer udglødes derefter på den tilbageholdte biotinylerede streng, hvilket gør det muligt at dispensere spirende DNA-syntese som deoxynukleotider i en foruddefineret rækkefølge i reaktionskammeret. Pyrosequenceren registrerer mængden af hver base, der er inkorporeret, baseret på en selvlysende aflæsning, hvilket muliggør den relative kvantificering af mutante og vildtype-mitokondriealleler ved DNA-syntese (figur 1B). Luminescensen genereres af et luciferaseenzym, som udsender lys i nærvær af ATP, som en ATP-sulfurylase syntetiserer de novo ved hver inkorporeringsbegivenhed fra pyrophosphaterne frigivet af hvert nukleotid. Disse to reaktioner kan opsummeres som følger:
1. PPi (fra nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP sulfurylase)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + lys (luciferase)
Det er en udfordring at detektere adeninbaser af pyrosequenceren uden ATP-krydsreaktion med luciferase i den anden reaktion. Dette løses imidlertid ved at anvende en adeninanalog til DNA-syntese, nemlig dATPαS. På trods af at det ikke er et perfekt substrat til luciferase, producerer det en stærkere luminescens sammenlignet med de tre andre nukleotider, som justeres digitalt af pyrosequenceren og indstilles til en faktor på 0,9. På grund af denne iboende variabilitet foreslås det at undgå sekventering af adenin ved SNP-positionen (se diskussionen for yderligere detaljer).
Følgende protokol beskriver metoden til mtDNA-heteroplasmatisk vurdering ved pyrosekventering og skitserer de nødvendige forholdsregler ved design af amplifikationsprimere for at undgå biologisk eller teknisk bias ved genotypebestemmelse af SNP’er i mtDNA. Sidstnævnte involverer digital opmåling og udvælgelse af primersæt, optimering af forforstærknings-PCR og endelig sekventering og raffinering af analysen. To anvendte eksempelanalyser demonstreres: for det første optimering af den mest almindelige humane patogene variant m.3243A>G18 og for det andet genotypning af museembryonale fibroblastceller (MEF), der har gennemgået heteroplasmiskift ved hjælp af teknologier udviklet på Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
Et kritisk aspekt for protokollens succes er at undgå kontamineringer, især når der anvendes små mængder udgangsmateriale. Det anbefales at bruge en UV-hætte og filtrerede pipettespidser, når prøverne forberedes, hvor det er muligt, samt at holde områderne med forforstærkning og efterforstærkning adskilt. Blindprøver og prøver af kendt heteroplasmi (såsom vildtype-DNA) bør altid medtages for at blive brugt som benchmarks til kontrol af teknisk eller biologisk bias.
En bemærkel…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Silvia Marchet og Constanza Lamperti (Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Fondazione IRCCS, Milano) for at forberede og levere m.3243A>G cybridceller, der anvendes som illustrative eksempler for denne protokol. Vi vil også gerne takke medlemmerne af Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) for nyttig diskussion i løbet af denne forskning. Dette arbejde blev støttet af kernefinansiering fra Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 og MC_UU_00028/3). P.A.N. og PS-P. er desuden støttet af henholdsvis The Lily Foundation og The Champ Foundation.
KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |