גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing
Summary
מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.
Abstract
מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי (mtDNA) נקשרו למחלות גנטיות תורשתיות אימהיות. עם זאת, העניין בפולימורפיזמים של mtDNA גדל בשנים האחרונות בשל היכולת שפותחה לאחרונה לייצר מודלים על ידי מוטגנזה mtDNA והערכה חדשה של הקשר בין סטיות גנטיות מיטוכונדריאליות ומחלות נפוצות הקשורות לגיל כגון סרטן, סוכרת ודמנציה. Pyrosequencing היא טכניקת ריצוף על ידי סינתזה הנמצאת בשימוש נרחב ברחבי שדה המיטוכונדריה עבור ניסויים גנוטיפיים שגרתיים. מחירה היחסי בהשוואה לשיטות ריצוף מקבילי מאסיביות וקלות היישום הופכים אותה לטכניקה רבת ערך בתחום הגנטיקה של המיטוכונדריה, ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עם גמישות מוגברת. למרות המעשיות של שיטה זו, יישומה כאמצעי לגנוטיפ mtDNA דורש תצפית על הנחיות מסוימות, במיוחד כדי למנוע הטיות מסוימות ממוצא ביולוגי או טכני. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים ואמצעי הזהירות הדרושים בתכנון ויישום מבחני pyrosequencing לשימוש בהקשר של מדידת הטרופלזמה.
Introduction
הגנום המיטוכונדריאלי קיים בצורה של מולקולות מעגליות קטנות (16.5 קילובייט) (mtDNA) הנמצאות בתא הפנימי ביותר של המיטוכונדריה הנקראות מטריצה ומקודדות 13 תת-יחידות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית, כמו גם את ה-tRNA וה-rRNA הדרושים לתרגומם באתרם על ידי הריבוזום המיטוכונדריאלי1. גנום זה מייצג כ-1% מכלל החלבונים הדרושים לתפקוד המיטוכונדריה, והשאר מקודדים על ידי הדנ”א הגרעיני (nDNA). מקובל להניח כי מיטוכונדריה נגזרים מאירוע איחוי אנדוסימביוטי בין אב קדמון אלפא-פרוטאובקטריאלי לבין תא איקריוטי קדמון. ברגע שסימביוזה היפותטית זו התרחשה, המידע הגנטי של המיטוכונדריה הועבר בהדרגה לגרעין במשך עידנים, מה שמסביר את הקומפקטיות הנ”ל של mtDNA בהשוואה לגנום של ציאנובקטריה מודרנית2. העברה כזו של גנים מתבטאת בצורה החזקה ביותר בקיומם של חלקים ארוכים של nDNA שהם הומולוגיים מאוד לרצפים הנמצאים ב- mtDNA. הרצפים המיטוכונדריאליים הגרעיניים האלה (NUMTs) הם מקור נפוץ לפרשנות שגויה במהלך גנוטיפ, ויש לנקוט אמצעי זהירות מסוימים כדי להימנע מהטיות גרעיניות בעת גנוטיפ mtDNA3 (איור 1A).
תכונה ייחודית נוספת של mtDNA היא שמספר העותקים שלו משתנה בהתאם לסוג התא, ומספור בין עשרות לאלפי עותקים לכל תא4. בשל אופי מרובה עותקים זה, mtDNA יכול להכיל מגוון רחב של גנוטיפים בתוך תא יחיד, מה שיכול לגרום לפיזור רציף יותר של אללים בניגוד לאללים בדידים הקשורים לגנים גרעיניים כאשר לוקחים בחשבון את הזיגוסיות של כרומוזומים. הטרוגניות זו של אללים מיטוכונדריאליים מכונה הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, המתבטאת בדרך כלל באחוז השכיחות של מוטציה נתונה כשיעור מסך mtDNA בתא נתון. הטרופלזמה יכולה להיות מנוגדת להומופלזמה, המתייחסת למין ייחודי של mtDNA שנמצא על פני תא.
מדידת הטרופלזמה של המיטוכונדריה מעניינת במיוחד כאשר מכמתים את חלקן של מולקולות mtDNA המכילות וריאנטים פתוגניים. גרסאות כאלה מגיעות בצורה של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), אינדל קטן, או מחיקות בקנה מידה גדול5. רוב בני האדם הם הטרופלזמיים עבור וריאנטים פתוגניים; עם זאת, הם אינם מציגים פנוטיפים קליניים, אשר לעתים קרובות מתבטאים רק ברמות הטרופלזמה גבוהות יותר של mtDNA פתוגני בתופעה המכונה אפקט סף6. בעוד הערכים הקשורים פתוגניות תלויים מאוד באופי של מוטציה פתוגנית ואת הרקמה שבה היא מתרחשת, הם בדרך כלל נמצאים מעל 60% הטרופלזמה7.
ישנם מספר תחומי מחקר בהם גנוטיפ מיטוכונדריאלי נפוץ. בתחום הרפואי, בדיקה או כימות של מוטציות mtDNA יכולות לשמש כקריטריון אבחוני למחלות מיטוכונדריאליות, שרבות מהן כוללות סטיות mtDNA כמקורשלהן 5. בנוסף לחקר מוטציות פתוגניות בבני אדם, השכיחות של מודלים של בעלי חיים המכילים SNPs פתוגניים ב- mtDNA צפויה לעלות, בהתחשב בהופעה האחרונה של עריכת בסיס מיטוכונדריאלי המתאפשרת על ידי עורכי בסיס ציטוזין ממוקדים במיטוכונדריה (DdCBEs)8 ו- DEAMINASES מבוססי TALE(TALEDs) לעריכת בסיס אדנין9. גישה זו תסייע בהבנת יחסי הגומלין בין גנוטיפים מיטוכונדריאליים חריגים לבין התפקוד הלקוי הנובע מכך. יש גם מחקר מדעי מתמשך על עיצוב מחדש של הגנום המיטוכונדריאלי לשימוש אולטימטיבי כאסטרטגיה טיפולית במחלות מיטוכונדריאליות אנושיות באמצעות גישה המכונה שינוי הטרופלזמה. תחום מחקר זה כולל בעיקר הכוונת נוקלאזות ספציפיות למוטציות למטריצה המיטוכונדריאלית; התוצאה היא השפלה מועדפת של mtDNA פתוגני, מה שמוביל להצלות בפנוטיפ 10,11,12,13. כל ניסוי הכרוך בעיצוב מחדש של הגנוטיפ המיטוכונדריאלי דורש שיטה כמותית חזקה כדי להעריך שינויים הטרופלזמה.
מגוון רחב של שיטות משמשות לגנוטיפ mtDNA, ואלה משתנות בהתאם לאופי המוטציה. שיטות ריצוף הדור הבא (NGS) מדויקות יותר כשמדובר בכימות SNPs ב- mtDNA; עם זאת, שיטות אלה נשארות יקרות מאוד לכימות שגרתי של הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, במיוחד אם מספר הדגימות קטן. ריצוף Sanger יכול גם לאפשר זיהוי של SNPs; עם זאת, גישה זו אינה כמותית ולעתים קרובות אינה מצליחה לזהות רמות נמוכות של הטרופלזמה או יכולה להיות לא מדויקת בעת הערכת הטרופלסמיה גבוהה. Pyrosequencing, כבדיקה הכרוכה בהכנה מינימלית ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עבור כל דגימת mtDNA, מוצעת כפשרה הולמת בין שני הקצוות הללו. שיטה זו שימשה באופן שגרתי לכימות SNPs מיטוכונדריאלי על ידי חוקרים רבים בהקשרים שונים, כולל ניתוח פורנזי 14,15, אבחנה קלינית16, או גנוטיפ של mtDNA מתאים בודדים17.
בדיקה זו כוללת שלב טרום הגברה ראשון של PCR של אזור הצמוד ל- SNP ב- mtDNA, ואחריו בדיקת רצף על ידי סינתזה באמצעות גדיל אחד של האמפליקון שנוצר בעבר. אחד משני הפריימרים המשמשים בשלב טרום ההגברה חייב להיות ביוטינילציה בקצה 5′, מה שיאפשר למנגנון הפירוזקוונס לבודד את גדיל הדנ”א היחיד שישמש כתבנית לתגובת הריצוף. לאחר מכן משליכים פריימר ריצוף שלישי על גדיל הביוטינילציה השמור, מה שמאפשר סינתזת דנ”א מתהווה כדאוקסינוקלאוטידים להיות מופצים בסדר מוגדר מראש לתוך תא התגובה. הפירורצ’ר רושם את הכמות של כל בסיס משולב בהתבסס על קריאה זוהרת, מה שמאפשר כימות יחסי של אללים מיטוכונדריאליים מוטנטיים ופראיים על סינתזת דנ”א (איור 1B). הלומינסנציה נוצרת על ידי אנזים לוציפראז, אשר פולט אור בנוכחות ATP כי ATP sulfurylase מסנתז דה נובו בכל אירוע התאגדות מן pyrophosphates שוחרר על ידי כל נוקלאוטיד. ניתן לסכם את שתי התגובות הללו כך:
1. PPi (משילוב נוקלאוטידים) + APS → ATP + סולפט (ATP סולפורילאז)
2. ATP + luciferin + O 2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + אור (luciferase)
איתור בסיסי אדנין על ידי הפירורצ’ר ללא ATP צולב עם לוציפראז בתגובה השנייה הוא אתגר. עם זאת, זה נפתר באמצעות אנלוגי אדנין עבור סינתזת DNA, כלומר dATPαS. למרות שאינו מצע מושלם עבור לוציפראז, הוא מייצר בהירות חזקה יותר בהשוואה לשלושת הנוקלאוטידים האחרים, אשר מכוונן דיגיטלית על ידי הפירורצ’ר ומוגדר לפקטור של 0.9. בשל שונות אינהרנטית זו, מוצע להימנע מריצוף אדנין בעמדת SNP (ראה דיון לפרטים נוספים).
הפרוטוקול הבא מפרט את השיטה של הערכת הטרופלזמה mtDNA על ידי pyrosequencing ומתאר את אמצעי הזהירות הדרושים בתכנון פריימרים הגברה כדי למנוע הטיה ביולוגית או טכנית בעת גנוטיפ SNPs ב mtDNA. האחרון כולל סקירה דיגיטלית ובחירת ערכות פריימר, אופטימיזציה של PCR טרום הגברה, ולבסוף, ריצוף וליטוש הבדיקה. שתי דוגמאות יישומיות מודגמות: ראשית, אופטימיזציה של הגרסה הפתוגנית האנושית הנפוצה ביותר m.3243A>G18, ושנית, גנוטיפ של תאי פיברובלסט עובריים של עכברים (MEF) שעברו הסטת הטרופלזמה באמצעות טכנולוגיות שפותחו במעבדת מינצ’וק בקיימברידג’ 10,11,12,19,20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
היבט קריטי להצלחת הפרוטוקול הוא הימנעות מזיהום, במיוחד בעת שימוש בכמויות נמוכות של חומר מוצא. מומלץ להשתמש בקולט אדים UV וקצוות פיפטה מסוננים בעת הכנת הדגימות במידת האפשר, כמו גם לשמור על הפרדה בין אזורי טרום הגברה ופוסט-הגברה. מדידות ריקות ודגימות של הטרופלזמה ידועה (כגון דנ”א מסוג פרא) צרי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לסילביה מרקט וקונסטנזה למפרטי (Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Fondazione IRCCS, Milan) על ההכנה והאספקה של תאי הציבריד m.3243A>G המשמשים כדוגמאות להמחשה עבור פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לחברי הקבוצה לגנטיקה מיטוכונדריאלית (MRC-MBU, אוניברסיטת קיימברידג’) על דיון שימושי במהלך מחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה למחקר רפואי בבריטניה (MC_UU_00015/4 ו- MC_UU_00028/3). פ.א.נ. ופ.ס.-פ. נתמכים בנוסף על ידי קרן לילי וקרן צ’אמפ, בהתאמה.
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
