Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Summary

Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.

Abstract

Mutationen im mitochondrialen Genom (mtDNA) werden mit mütterlich vererbten genetischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Das Interesse an mtDNA-Polymorphismen hat jedoch in den letzten Jahren zugenommen, da in jüngster Zeit die Fähigkeit entwickelt wurde, Modelle durch mtDNA-Mutagenese zu erstellen, und eine neue Erkenntnis des Zusammenhangs zwischen mitochondrialen genetischen Aberrationen und häufigen altersbedingten Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Demenz entwickelt wurde. Die Pyrosequenzierung ist eine Sequenzierungstechnik durch Synthese, die im gesamten mitochondrialen Bereich für routinemäßige Genotypisierungsexperimente weit verbreitet ist. Ihre relative Erschwinglichkeit im Vergleich zu massiven parallelen Sequenzierungsmethoden und die einfache Implementierung machen sie zu einer unschätzbaren Technik auf dem Gebiet der mitochondrialen Genetik, die eine schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie mit erhöhter Flexibilität ermöglicht. Trotz der Praktikabilität dieser Methode erfordert ihre Implementierung als Mittel zur mtDNA-Genotypisierung die Einhaltung bestimmter Richtlinien, insbesondere um bestimmte Verzerrungen biologischen oder technischen Ursprungs zu vermeiden. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte und Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung und Implementierung von Pyrosequenzierungsassays für die Verwendung im Zusammenhang mit der Heteroplasmiemessung.

Introduction

Das mitochondriale Genom liegt in Form von kleinen (16,5 kb) kreisförmigen Molekülen (mtDNA) vor, die im innersten Kompartiment der Mitochondrien vorhanden sind, die als Matrix bezeichnet werden und für 13 Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette sowie die tRNAs und rRNAs kodieren, die für ihre Translation in situ durch das mitochondriale Ribosom¹ erforderlich sind. Dieses Genom repräsentiert etwa 1% aller Proteine, die für die Funktion der Mitochondrien notwendig sind, der Rest wird von der Kern-DNA (nDNA) kodiert. Es wird allgemein angenommen, dass Mitochondrien aus einem endosymbiotischen Fusionsereignis zwischen einem alpha-proteobakteriellen Vorfahren und einer eukaryotischen Urzelle stammen. Sobald diese hypothetische Symbiose stattgefunden hatte, wurde die genetische Information der Mitochondrien über Äonen hinweg allmählich in den Zellkern übertragen, was die bereits erwähnte Kompaktheit der mtDNA im Vergleich zu den Genomen moderner Cyanobakterien^{erklärt 2}. Ein solcher Transfer von Genen wird am stärksten durch die Existenz langer nDNA-Abschnitte belegt, die in hohem Maße homolog zu den in der mtDNA gefundenen Sequenzen sind. Diese nukleären mitochondrialen Sequenzen (NUMTs) sind eine häufige Quelle für Fehlinterpretationen während der Genotypisierung, und es müssen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um nukleäre Verzerrungen bei der Genotypisierung von mtDNA³ zu vermeiden (Abbildung 1A).

Eine weitere Besonderheit der mtDNA besteht darin, dass ihre Kopienzahl je nach Zelltyp variiert und zwischen Zehntausenden und Tausenden von Kopien pro Zelle liegt⁴. Aufgrund dieser mehrfachen Kopiennatur kann mtDNA eine Vielzahl von Genotypen innerhalb einer einzigen Zelle beherbergen, was zu einer kontinuierlicheren Verteilung der Allele führen kann, im Gegensatz zu den diskreten Allelen, die mit Kerngenen assoziiert sind, wenn man die Zygotie der Chromosomen betrachtet. Diese Heterogenität der mitochondrialen Allele wird als mitochondriale Heteroplasmie bezeichnet, die sich typischerweise in der prozentualen Prävalenz einer bestimmten Mutation im Verhältnis zur gesamten mtDNA in einer bestimmten Zelle ausdrückt. Heteroplasmie kann der Homoplasmie gegenübergestellt werden, die sich auf eine einzigartige Art von mtDNA bezieht, die in einer Zelle vorhanden ist.

Die Messung der mitochondrialen Heteroplasmie ist von besonderem Interesse bei der Quantifizierung des Anteils von mtDNA-Molekülen, die pathogene Varianten beherbergen. Solche Varianten gibt es in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), kleinen Indels oder großflächigen Deletionen⁵. Die meisten Menschen sind heteroplasmatisch für pathogene Varianten; Sie weisen jedoch keine klinischen Phänotypen auf, die sich oft nur bei höheren Heteroplasmie-Konzentrationen pathogener mtDNA manifestieren, was als Schwelleneffekt^{bezeichnet wird 6}. Während die mit der Pathogenität assoziierten Werte stark von der Art der pathogenen Mutation und dem Gewebe, in dem sie auftritt, abhängen, liegen sie typischerweise über 60% Heteroplasmie⁷.

Es gibt mehrere Forschungsbereiche, in denen die mitochondriale Genotypisierung üblich ist. Im medizinischen Bereich kann die Untersuchung oder Quantifizierung von mtDNA-Mutationen als diagnostisches Kriterium für mitochondriale Erkrankungen dienen, von denen viele auf mtDNA-Aberrationen zurückzuführen sind⁵. Neben der Untersuchung humanpathogener Mutationen wird die Prävalenz von Tiermodellen, die pathogene SNPs in der mtDNA enthalten, wahrscheinlich zunehmen, da in jüngster Zeit die mitochondriale Baseneditierung durch mitochondriale DddA-abgeleitete Cytosin-Baseneditoren (DdCBEs)⁸ und TALE-basierte Deaminasen (TALEDs) für die Adenin-Basen-Editierung ermöglicht wird⁹. Dieser Ansatz wird entscheidend dazu beitragen, das Zusammenspiel zwischen abweichenden mitochondrialen Genotypen und den daraus resultierenden Funktionsstörungen zu verstehen. Es gibt auch laufende wissenschaftliche Forschungen zum Umbau des mitochondrialen Genoms für den endgültigen Einsatz als therapeutische Strategie bei menschlichen mitochondrialen Erkrankungen durch einen Ansatz, der als Heteroplasmieverschiebung bekannt ist. In diesem Forschungsgebiet geht es vor allem darum, mutationsspezifische Nukleasen auf die mitochondriale Matrix zu lenken; Dies führt zu einem bevorzugten Abbau pathogener mtDNA, was zu Rettungen beim Phänotyp^10,11,12,13 führt. Alle Experimente, die den Umbau des mitochondrialen Genotyps beinhalten, erfordern eine robuste quantitative Methode zur Beurteilung von Heteroplasmieverschiebungen.

Für die Genotypisierung der mtDNA wird eine Vielzahl von Methoden verwendet, die je nach Art der Mutation variieren. Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) sind präziser, wenn es um die Quantifizierung von SNPs in der mtDNA geht. Diese Methoden sind jedoch für die routinemäßige Quantifizierung der mitochondrialen Heteroplasmie nach wie vor unerschwinglich teuer, insbesondere wenn die Anzahl der Proben gering ist. Die Sanger-Sequenzierung kann auch die Erkennung von SNPs ermöglichen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht quantitativ und kann bei der Schätzung hoher Heteroplasmien oft nicht erkannt werden oder ungenau sein. Die Pyrosequenzierung als Assay, der nur minimale Vorbereitung erfordert und die schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie für jede mtDNA-Probe ermöglicht, wird als geeigneter Kompromiss zwischen diesen beiden Extremen vorgeschlagen. Diese Methode wurde von zahlreichen Forschern routinemäßig zur Quantifizierung mitochondrialer SNPs in verschiedenen Kontexten eingesetzt, darunter forensische Analysen 14,15^, klinische Diagnosen¹⁶ oder die Genotypisierung von mtDNA aus Einzelzellen¹⁷.

Dieser Assay beinhaltet einen ersten PCR-Präamplifikationsschritt einer Region, die den SNP in der mtDNA flankiert, gefolgt von einem Sequenzierungs-by-Synthesis-Assay mit einem Strang des zuvor erzeugten Amplikons. Einer der beiden Primer, die im Voramplifikationsschritt verwendet werden, muss am 5′-Ende biotinyliert werden, wodurch die Pyrosequenziervorrichtung in die Lage versetzt wird, den einzelnen DNA-Strang zu isolieren, der als Vorlage für die Sequenzierungsreaktion verwendet werden soll. Ein dritter Sequenzierprimer wird dann auf den zurückgehaltenen biotinylierten Strang getempert, wodurch die entstehende DNA-Synthese in Form von Desoxynukleotide in einer vordefinierten Reihenfolge in die Reaktionskammer abgegeben werden kann. Der Pyrosequenzer zeichnet die Menge jeder eingebauten Base auf der Grundlage einer Lumineszenzanzeige auf und ermöglicht so die relative Quantifizierung von mutierten und mitochondrialen Allelen des Wildtyps bei der DNA-Synthese (Abbildung 1B). Die Lumineszenz wird durch ein Luciferase-Enzym erzeugt, das in Gegenwart von ATP Licht emittiert, das eine ATP-Sulfurylase bei jedem Einbauereignis de novo aus den von jedem Nukleotid freigesetzten Pyrophosphaten synthetisiert. Diese beiden Reaktionen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. PP_i (aus Nukleotideinbau) + APS → ATP + Sulfat (ATP-Sulfurylase)

2. ATP + Luciferin +_O2 → AMP + PP_i + Oxyluciferin + CO₂ + Licht (Luciferase)

Der Nachweis von Adeninbasen durch den Pyrosequenzer, ohne dass ATP in der zweiten Reaktion mit der Luciferase kreuzreagiert, ist eine Herausforderung. Dies wird jedoch durch die Verwendung eines Adenin-Analogons für die DNA-Synthese, nämlich dATPαS, gelöst. Obwohl es kein perfektes Substrat für Luciferase ist, erzeugt es im Vergleich zu den drei anderen Nukleotiden eine stärkere Lumineszenz, die vom Pyrosequenzer digital eingestellt und auf den Faktor 0,9 eingestellt wird. Aufgrund dieser inhärenten Variabilität wird empfohlen, die Sequenzierung von Adenin an der SNP-Position zu vermeiden (siehe die Diskussion für weitere Details).

Das folgende Protokoll beschreibt die Methode der Bewertung der mtDNA-Heteroplasmie durch Pyrosequenzierung und beschreibt die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung der Amplifikationsprimer, um biologische oder technische Verzerrungen bei der Genotypisierung von SNPs in mtDNA zu vermeiden. Letzteres umfasst die digitale Vermessung und Auswahl der Primer-Sets, die Optimierung der Präamplifikations-PCR und schließlich die Sequenzierung und Verfeinerung des Assays. Es werden zwei angewandte Beispielassays demonstriert: erstens die Optimierung der häufigsten humanpathogenen Variante m.3243A>G¹⁸ und zweitens die Genotypisierung von embryonalen Fibroblastenzellen (MEF) von Mäusen, die eine Heteroplasmieverschiebung durchlaufen haben, unter Verwendung von Technologien, die im Minczuk-Labor in Cambridge entwickelt wurden 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

Für die Verwendung der humanen 3243A>G-Cybridzellen und der in dieser Studie verwendeten immortalisierten m.5024C>T-MEFs wurde eine Einwilligungserklärung erteilt. Eine ethische Genehmigung war in diesem Fall nicht erforderlich, da die Patientenzellen nicht an der Universität Cambridge entnommen wurden. Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann jedoch eine ethische Genehmigung erfordern. Es wird dringend empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben-DNA für die Pyrosequenzierung die Best Practices für die PCR-Einri…

Representative Results

In diesem Abschnitt werden ein Beispiel für die Optimierung eines Pyrosequenzierungsassays für eine humanpathogene mtDNA-Mutation sowie Sequenzierungsdaten aus der Genotypisierung von heteroplasmatischen (m.5024C>T) embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vorgestellt, die mit mitochondrialen Zinkfingernukleasen (mtZFNs) behandelt wurden. Die Optimierung des Assays für menschliche Zellen und der Vergleich zweier verschiedener Assays zeigt, wie der genaueste ausgewählt werden kann, während die Genotypisierung genetis…

Discussion

Ein kritischer Aspekt für den Erfolg des Protokolls ist die Vermeidung von Kontaminationen, insbesondere bei der Verwendung geringer Mengen an Ausgangsmaterial. Es wird empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben nach Möglichkeit eine UV-Haube und gefilterte Pipettenspitzen zu verwenden sowie die Bereiche vor und nach der Verstärkung getrennt zu halten. Blindproben und Proben bekannter Heteroplasmie (z. B. Wildtyp-DNA) sollten immer als Benchmarks verwendet werden, um technische oder biologische Verzerrungen zu überpr…

Materials

KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325