Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage

Summary

Les tests de pyroséquençage permettent le génotypage robuste et rapide des polymorphismes mononucléotidiques de l’ADN mitochondrial dans des cellules ou des tissus hétéroplasmiques.

Abstract

Des mutations dans le génome mitochondrial (ADNmt) ont été associées à des maladies génétiques héréditaires de la mère. Cependant, l’intérêt pour les polymorphismes de l’ADNmt a augmenté ces dernières années en raison de la capacité récemment développée de produire des modèles par mutagénèse de l’ADNmt et d’une nouvelle appréciation de l’association entre les aberrations génétiques mitochondriales et les maladies courantes liées à l’âge telles que le cancer, le diabète et la démence. Le pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse largement utilisée dans le domaine mitochondrial pour les expériences de génotypage de routine. Son prix relativement abordable par rapport aux méthodes de séquençage parallèle massif et sa facilité de mise en œuvre en font une technique inestimable dans le domaine de la génétique mitochondriale, permettant la quantification rapide de l’hétéroplasmie avec une flexibilité accrue. Malgré l’aspect pratique de cette méthode, sa mise en œuvre en tant que moyen de génotypage de l’ADNmt nécessite le respect de certaines lignes directrices, notamment pour éviter certains biais d’origine biologique ou technique. Ce protocole décrit les étapes et les précautions nécessaires à la conception et à la mise en œuvre de tests de pyroséquençage à utiliser dans le contexte de la mesure de l’hétéroplasmie.

Introduction

Le génome mitochondrial existe sous la forme de petites molécules circulaires (16,5 kb) (ADNmt) présentes dans le compartiment le plus interne des mitochondries nommé matrice et code 13 sous-unités de la chaîne respiratoire mitochondriale, ainsi que les ARNt et les ARNr nécessaires à leur traduction in situ par le ribosome mitochondrial¹. Ce génome représente environ 1% de toutes les protéines nécessaires à la fonction mitochondriale, dont le reste est codé par l’ADN nucléaire (ADNn). Il est communément admis que les mitochondries sont dérivées d’un événement de fusion endosymbiotique entre un ancêtre alpha-protéobactérien et une cellule eucaryote ancestrale. Une fois cette symbiose hypothétique effectuée, l’information génétique des mitochondries a été progressivement transférée au noyau au fil des éons, ce qui explique la compacité susmentionnée de l’ADNmt par rapport aux génomes des cyanobactéries^{modernes 2}. Un tel transfert de gènes est le plus fortement mis en évidence par l’existence de longues étendues d’ADNn qui sont hautement homologues aux séquences trouvées dans l’ADNmt. Ces séquences mitochondriales nucléaires (NUMT) sont une source fréquente de mauvaise interprétation lors du génotypage, et certaines précautions doivent être prises pour éviter les biais nucléaires lors du génotypage de^{l’ADNmt 3} (Figure 1A).

Une autre caractéristique distinctive de l’ADNmt est que son nombre de copies varie en fonction du type de cellule, allant de dizaines à des milliers de copies par cellule⁴. En raison de cette nature multi-copie, l’ADNmt peut héberger un large éventail de génotypes au sein d’une seule cellule, ce qui peut entraîner une distribution plus continue des allèles contrairement aux allèles discrets associés aux gènes nucléaires lorsque l’on considère la zygotie des chromosomes. Cette hétérogénéité des allèles mitochondriaux est appelée hétéroplasmie mitochondriale, qui est généralement exprimée en pourcentage de prévalence d’une mutation donnée en proportion de l’ADNmt total dans une cellule donnée. L’hétéroplasmie peut être comparée à l’homoplasmie, qui fait référence à une espèce unique d’ADNmt présente dans une cellule.

La mesure de l’hétéroplasmie mitochondriale est particulièrement intéressante pour quantifier la proportion de molécules d’ADNmt abritant des variantes pathogènes. Ces variantes se présentent sous la forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), de petits indels ou de délétions à grande échelle⁵. La plupart des humains sont hétéroplasmiques pour les variantes pathogènes; cependant, ils ne présentent aucun phénotype clinique, qui ne se manifeste souvent qu’à des niveaux d’hétéroplasmie plus élevés d’ADNmt pathogène dans un phénomène appelé effet seuil⁶. Bien que les valeurs associées à la pathogénicité dépendent fortement de la nature de la mutation pathogène et du tissu dans lequel elle se produit, elles se situent généralement au-dessus de 60 % d’hétéroplasmie⁷.

Il existe plusieurs domaines de recherche dans lesquels le génotypage mitochondrial est courant. Dans le domaine médical, tester ou quantifier les mutations de l’ADNmt peut servir de critère diagnostique pour les maladies mitochondriales, dont beaucoup ont des aberrations d’ADNmt comme origine⁵. En plus de l’étude des mutations pathogènes humaines, la prévalence des modèles animaux hébergeant des SNP pathogènes dans l’ADNmt est susceptible d’augmenter, compte tenu de l’avènement récent de l’édition de bases mitochondriales rendue possible par les éditeurs de bases cytosines dérivées de DddA (DdCBEs)⁸ et les désaminases basées sur TALE (TALEDs) ciblant les mitochondries pour l’édition de bases d’adénine⁹. Cette approche sera déterminante pour comprendre l’interaction entre les génotypes mitochondriaux aberrants et les dysfonctionnements qui en résultent. Des recherches scientifiques sont également en cours sur le remodelage du génome mitochondrial pour une utilisation ultime en tant que stratégie thérapeutique dans les maladies mitochondriales humaines via une approche connue sous le nom de déplacement de l’hétéroplasmie. Ce domaine de recherche consiste principalement à diriger les nucléases spécifiques à la mutation vers la matrice mitochondriale; il en résulte la dégradation préférentielle de l’ADNmt pathogène, conduisant à des sauvetages dans le phénotype^10,11,12,13. Toute expérience impliquant le remodelage du génotype mitochondrial nécessite une méthode quantitative robuste pour évaluer les changements d’hétéroplasmie.

Une grande variété de méthodes sont utilisées pour génotyper l’ADNmt, et celles-ci varient selon la nature de la mutation. Les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont plus précises lorsqu’il s’agit de quantifier les SNP dans l’ADNmt; Cependant, ces méthodes restent prohibitives pour la quantification de routine de l’hétéroplasie mitochondriale, en particulier si le nombre d’échantillons est faible. Le séquençage de Sanger peut également permettre la détection des SNP; Cependant, cette approche n’est pas quantitative et ne parvient souvent pas à détecter de faibles niveaux d’hétéroplasmie ou peut être inexacte lors de l’estimation des hétéroplasmies élevées. Le pyroséquençage, en tant que test qui implique une préparation minimale et permet la quantification rapide de l’hétéroplasmie pour n’importe quel échantillon d’ADNmt, est proposé comme un compromis approprié entre ces deux extrêmes. Cette méthode a été utilisée couramment pour quantifier les SNP mitochondriaux par de nombreux chercheurs dans divers contextes, y compris l’analyse médico-légale 14,15, le diagnostic clinique^16, ou le génotypage de l’ADNmt à partir de cellules individuelles¹⁷.

Ce test implique une première étape de préamplification par PCR d’une région flanquant le SNP dans l’ADNmt, suivie d’un test de séquençage par synthèse utilisant un brin de l’amplicon précédemment généré. L’une des deux amorces utilisées dans l’étape de préamplification doit être biotinylée à l’extrémité 5′, ce qui permettra à l’appareil de pyroséquençage d’isoler le simple brin d’ADN à utiliser comme modèle pour la réaction de séquençage. Une troisième amorce de séquençage est ensuite recuite sur le brin biotinylé retenu, ce qui permet de distribuer la synthèse naissante de l’ADN sous forme de désoxynucléotides dans un ordre prédéfini dans la chambre de réaction. Le pyroséquenceur enregistre la quantité de chaque base incorporée sur la base d’une lecture luminescente, permettant la quantification relative des allèles mitochondriaux mutants et de type sauvage lors de la synthèse de l’ADN (Figure 1B). La luminescence est générée par une enzyme luciférase, qui émet de la lumière en présence d’ATP qu’une ATP sulfurylase synthétise de novo à chaque événement d’incorporation à partir des pyrophosphates libérés par chaque nucléotide. Ces deux réactions peuvent se résumer comme suit :

1. PP_i (à partir de l’incorporation de nucléotides) + APS → ATP + sulfate (ATP sulfurylase)

2. ATP + luciférine +_O2 → AMP + PP_i + oxyluciférine + CO₂ + lumière (luciférase)

La détection des bases adénine par le pyroséquenceur sans réaction croisée de l’ATP avec la luciférase dans la deuxième réaction est un défi. Cependant, ceci est résolu en utilisant un analogue de l’adénine pour la synthèse de l’ADN, à savoir dATPαS. Bien qu’il ne s’agisse pas d’un substrat parfait pour la luciférase, il produit une luminescence plus forte par rapport aux trois autres nucléotides, qui est ajustée numériquement par le pyroséquenceur et réglée sur un facteur de 0,9. En raison de cette variabilité inhérente, il est suggéré d’éviter le séquençage de l’adénine à la position SNP (voir la discussion pour plus de détails).

Le protocole suivant détaille la méthode d’évaluation de l’hétéroplasmie de l’ADNmt par pyroséquençage et décrit les précautions nécessaires lors de la conception des amorces d’amplification pour éviter les biais biologiques ou techniques lors du génotypage des SNP dans l’ADNmt. Ce dernier implique l’étude numérique et la sélection des ensembles d’amorces, l’optimisation de la PCR de préamplification et, enfin, le séquençage et le raffinement du test. Deux exemples d’essais appliqués sont démontrés : premièrement, l’optimisation de la variante pathogène humaine la plus courante m.3243A>G¹⁸, et deuxièmement, le génotypage de cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) qui ont subi un déplacement d’hétéroplasmie à l’aide de technologies développées au laboratoire Minczuk à Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules cybrides humaines 3243A>G et des MEF m.5024C>T immortalisés utilisés dans cette étude. L’approbation éthique n’était pas requise dans ce cas, car les cellules des patients n’ont pas été collectées à l’Université de Cambridge. L’utilisation de fibroblastes humains peut toutefois nécessiter une approbation éthique. Il est fortement recommandé de suivre les meilleures pratiques pour la configuration de la PCR lors de la prépar…

Representative Results

Cette section présente un exemple d’optimisation d’un test de pyroséquençage pour une mutation de l’ADNmt pathogène humain, ainsi que des données de séquençage provenant du génotypage de fibroblastes embryonnaires de souris hétéroplasmiques (m.5024C>T) traités avec des nucléases mitochondriales à doigts de zinc (mtZFN). L’optimisation du dosage pour les cellules humaines et la comparaison de deux tests différents montrent comment sélectionner le plus précis, tandis que le génotypage des cellules …

Discussion

Un aspect essentiel pour le succès du protocole est d’éviter les contaminations, en particulier lors de l’utilisation de faibles quantités de matières premières. Il est recommandé d’utiliser une hotte UV et des pointes de pipettes filtrées lors de la préparation des échantillons dans la mesure du possible, ainsi que de séparer les zones de préamplification et de post-amplification. Des mesures à blanc et des échantillons d’hétéroplasmie connue (tels que l’ADN de type sauvage) doivent toujours êt…

Materials

KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325