Genotyping av enkeltnukleotidpolymorfismer i mitokondriegenomet ved pyrosekvensering
Summary
Pyrosekvenseringsanalyser muliggjør robust og rask genotyping av mitokondrielle DNA-enkeltnukleotidpolymorfismer i heteroplasmatiske celler eller vev.
Abstract
Mutasjoner i mitokondriegenomet (mtDNA) har vært assosiert med maternelt arvelige genetiske sykdommer. Imidlertid har interessen for mtDNA-polymorfismer økt de siste årene på grunn av den nylig utviklede evnen til å produsere modeller ved mtDNA-mutagenese og en ny forståelse av sammenhengen mellom mitokondrielle genetiske avvik og vanlige aldersrelaterte sykdommer som kreft, diabetes og demens. Pyrosekvensering er en sekvenserings-for-syntese-teknikk som er mye brukt over mitokondriefeltet for rutinemessige genotypingseksperimenter. Dens relative overkommelighet sammenlignet med massive parallelle sekvenseringsmetoder og enkel implementering gjør det til en uvurderlig teknikk innen mitokondriell genetikk, noe som muliggjør rask kvantifisering av heteroplasmy med økt fleksibilitet. Til tross for den praktiske egenskapen til denne metoden, krever implementeringen som et middel til mtDNA-genotyping observasjon av visse retningslinjer, spesielt for å unngå visse forstyrrelser av biologisk eller teknisk opprinnelse. Denne protokollen skisserer de nødvendige trinnene og forholdsreglene ved utforming og implementering av pyrosekvenseringsanalyser for bruk i forbindelse med heteroplasmimåling.
Introduction
Mitokondriegenomet eksisterer i form av små (16, 5 kb) sirkulære molekyler (mtDNA) tilstede i det innerste rommet i mitokondriene kalt matrisen og koder for 13 underenheter av mitokondriell respiratorisk kjede, samt tRNA og rRNA som er nødvendige for deres oversettelse in situ av mitokondriell ribosom1. Dette genomet representerer ca. 1% av alle proteiner som er nødvendige for mitokondriell funksjon, hvorav resten er kodet av nukleært DNA (nDNA). Det antas vanligvis at mitokondrier er avledet fra en endosymbiotisk fusjonshendelse mellom en alfa-proteobakteriell forfader og en forfedre eukaryot celle. Når denne hypotetiske symbiosen fant sted, ble den genetiske informasjonen til mitokondriene gradvis overført til kjernen over eoner, noe som forklarer den nevnte kompaktiteten til mtDNA sammenlignet med genomene til moderne cyanobakterier2. En slik overføring av gener er sterkest bevist av eksistensen av lange strekninger av nDNA som er svært homologe med sekvensene som finnes i mtDNA. Disse nukleære mitokondriesekvensene (NUMT) er en vanlig kilde til feiltolkning under genotyping, og visse forholdsregler må tas for å unngå nukleære skjevheter ved genotyping av mtDNA3 (figur 1A).
Et annet karakteristisk trekk ved mtDNA er at kopinummeret varierer avhengig av celletype, og nummererer alt fra titusenvis til tusenvis av kopier per celle4. På grunn av denne multikopieringsnaturen kan mtDNA ha et bredt spekter av genotyper i en enkelt celle, noe som kan resultere i en mer kontinuerlig fordeling av alleler i motsetning til de diskrete allelene assosiert med nukleære gener når man vurderer zygositeten til kromosomer. Denne heterogeniteten av mitokondrielle alleler blir referert til som mitokondriell heteroplasmi, som vanligvis uttrykkes i prosentvis prevalens av en gitt mutasjon som en andel av det totale mtDNA i en gitt celle. Heteroplasmy kan kontrasteres med homoplasmi, som refererer til at en unik art av mtDNA er tilstede over en celle.
Måling av mitokondriell heteroplasmy er av spesiell interesse når man kvantifiserer andelen mtDNA-molekyler som har patogene varianter. Slike varianter kommer i form av single nucleotide polymorphisms (SNPs), små indels eller store delesjoner5. De fleste mennesker er heteroplasmatiske for patogene varianter; Imidlertid viser de ingen kliniske fenotyper, som ofte bare manifesterer seg ved høyere heteroplasminivåer av patogent mtDNA i et fenomen referert til som terskeleffekten6. Mens verdiene assosiert med patogenisitet er svært avhengige av arten av den patogene mutasjonen og vevet der den forekommer, ligger de vanligvis over 60% heteroplasmy7.
Det er flere forskningsområder der mitokondriell genotyping er vanlig. På det medisinske området kan testing for eller kvantifisering av mtDNA-mutasjoner tjene som et diagnostisk kriterium for mitokondriesykdommer, hvorav mange har mtDNA-avvik som opprinnelse5. I tillegg til studiet av humanpatogene mutasjoner, vil forekomsten av dyremodeller som inneholder patogene SNPer i mtDNA sannsynligvis øke, gitt den nylige fremkomsten av mitokondriell baseredigering aktivert av mitokondrielt målrettede DddA-avledede cytosinbaseredaktører (DdCBEs)8 og TALE-baserte deaminaser (TALEDs) for adeninbaseredigering9. Denne tilnærmingen vil være medvirkende til å forstå samspillet mellom avvikende mitokondrielle genotyper og de resulterende dysfunksjonene. Det er også pågående vitenskapelig forskning for å omforme mitokondriegenomet til ultimat bruk som en terapeutisk strategi i menneskelige mitokondrielle sykdommer via en tilnærming kjent som heteroplasmi-skifting. Dette forskningsfeltet innebærer primært å lede mutasjonsspesifikke nukleaser til mitokondriematrisen; Dette resulterer i fortrinnsvis nedbrytning av patogent mtDNA, noe som fører til redning i fenotype10,11,12,13. Eventuelle eksperimenter som involverer remodellering av mitokondriell genotype krever en robust kvantitativ metode for å vurdere heteroplasmiskift.
Et bredt spekter av metoder brukes til å genotype mtDNA, og disse varierer i henhold til mutasjonens natur. Neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS) er mer presise når det gjelder kvantifisering av SNP-er i mtDNA; Imidlertid forblir disse metodene uoverkommelig dyre for rutinemessig kvantifisering av mitokondriell heteroplasmi, spesielt hvis antall prøver er små. Sanger-sekvensering kan også tillate deteksjon av SNP-er; Denne tilnærmingen er imidlertid ikke kvantitativ og klarer ofte ikke å oppdage lave nivåer av heteroplasmi eller kan være unøyaktig når man estimerer høye heteroplasmier. Pyrosekvensering, som en analyse som involverer minimal forberedelse og muliggjør rask kvantifisering av heteroplasmy for enhver mtDNA-prøve, foreslås som et passende kompromiss mellom disse to ytterpunktene. Denne metoden har blitt brukt rutinemessig for å kvantifisere mitokondrielle SNPs av mange forskere i ulike sammenhenger, inkludert rettsmedisinsk analyse 14,15, klinisk diagnose16, eller genotyping av mtDNA fra enkeltceller17.
Denne analysen innebærer et første PCR-forsterkningstrinn i en region som flankerer SNP i mtDNA, som etterfølges av en sekvenserings-for-syntese-analyse ved bruk av en streng av den tidligere genererte amplikonen. En av de to primerne som brukes i foramplifiseringstrinnet må biotinyleres på 5′-enden, noe som vil gjøre det mulig for pyrosekvenseringsapparatet å isolere den ene DNA-strengen som skal brukes som mal for sekvenseringsreaksjonen. En tredje sekvenseringsprimer blir deretter glødet på den beholdte biotinylerte strengen, noe som gjør det mulig for begynnende DNA-syntese som deoksynukleotider som skal dispenseres i en forhåndsdefinert rekkefølge i reaksjonskammeret. Pyrosequenceren registrerer mengden av hver base innlemmet basert på en luminescerende avlesning, noe som tillater den relative kvantifiseringen av mutante og villtype mitokondrielle alleler ved DNA-syntese (figur 1B). Luminescensen genereres av et luciferase-enzym, som avgir lys i nærvær av ATP som en ATP-sulfurylase syntetiserer de novo ved hver inkorporeringshendelse fra pyrofosfatene frigjort av hvert nukleotid. Disse to reaksjonene kan oppsummeres som følger:
1. PPi (fra nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP-sulfurylase)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oksyluciferin + CO2 + lys (luciferase)
Å oppdage adeninbaser av pyrosequenceren uten at ATP kryssreagerer med luciferase i den andre reaksjonen er en utfordring. Dette løses imidlertid ved å bruke en adeninanalog for DNA-syntese, nemlig dATPαS. Til tross for at det ikke er et perfekt substrat for luciferase, produserer det en sterkere luminescens sammenlignet med de tre andre nukleotidene, som er digitalt justert av pyrosequenceren og satt til en faktor på 0,9. På grunn av denne iboende variasjonen foreslås det å unngå sekvensering av adenin ved SNP-posisjonen (se diskusjonen for ytterligere detaljer).
Følgende protokoll beskriver metoden for mtDNA-heteroplasmivurdering ved pyrosekvensering og skisserer de nødvendige forholdsregler ved utforming av amplifikasjonsprimere for å unngå biologisk eller teknisk skjevhet ved genotyping av SNPer i mtDNA. Sistnevnte innebærer digital kartlegging og valg av primersettene, optimalisering av forforsterker-PCR, og til slutt sekvensering og raffinering av analysen. To anvendte eksempelanalyser er demonstrert: For det første optimalisering av den vanligste humanpatogene varianten m.3243A>G18, og for det andre genotyping av musembryonale fibroblastceller (MEF) som har gjennomgått heteroplasmiskifting ved hjelp av teknologier utviklet ved Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk aspekt for protokollens suksess er å unngå forurensninger, spesielt ved bruk av lave mengder utgangsmateriale. Det anbefales å bruke en UV-hette og filtrerte pipettespisser når prøvene tilberedes der det er mulig, samt å holde forforsterker- og etterforsterkningsområdene atskilt. Blanke målinger og prøver av kjent heteroplasmi (som villtype-DNA) bør alltid inkluderes for å brukes som målestokk for å kontrollere for teknisk eller biologisk skjevhet.
En bemerkelsesverdig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Silvia Marchet og Constanza Lamperti (Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Fondazione IRCCS, Milano) for å forberede og levere m.3243A>G cybridceller som brukes som illustrerende eksempler for denne protokollen. Vi ønsker også å anerkjenne medlemmene av Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) for nyttig diskusjon i løpet av denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av kjernefinansiering fra Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 og MC_UU_00028/3). P.A.N. og P.S.-P. støttes i tillegg av henholdsvis The Lily Foundation og The Champ Foundation.
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
