Genotypning av enstaka nukleotidpolymorfismer i mitokondriellt genom pyrosequencing
Summary
Pyrosequencing-analyser möjliggör robust och snabb genotypning av mitokondriellt DNA-enkelnukleotidpolymorfismer i heteroplasmatiska celler eller vävnader.
Abstract
Mutationer i mitokondriellt genom (mtDNA) har associerats med maternellt ärftliga genetiska sjukdomar. Intresset för mtDNA-polymorfismer har dock ökat de senaste åren på grund av den nyligen utvecklade förmågan att producera modeller med mtDNA-mutagenes och en ny uppskattning av sambandet mellan mitokondriella genetiska avvikelser och vanliga åldersrelaterade sjukdomar som cancer, diabetes och demens. Pyrosequencing är en sekvenserings-för-syntes-teknik som används allmänt över mitokondriella fältet för rutinmässiga genotypningsexperiment. Dess relativa överkomliga jämfört med massiva parallella sekvenseringsmetoder och enkel implementering gör det till en ovärderlig teknik inom mitokondriell genetik, vilket möjliggör snabb kvantifiering av heteroplasmi med ökad flexibilitet. Trots praktiken av denna metod kräver dess genomförande som ett medel för mtDNA-genotypning observation av vissa riktlinjer, särskilt för att undvika vissa fördomar av biologiskt eller tekniskt ursprung. Detta protokoll beskriver nödvändiga steg och försiktighetsåtgärder vid utformning och implementering av pyrosequencing-analyser för användning i samband med heteroplasmimätning.
Introduction
Det mitokondriella genomet existerar i form av små (16, 5 kb) cirkulära molekyler (mtDNA) närvarande i mitokondriernas innersta fack som heter matrisen och kodar för 13 subenheter i mitokondriell andningskedja, liksom de tRNA och rRNA som är nödvändiga för deras översättning in situ av mitokondriell ribosom1. Detta genom representerar ungefär 1% av alla proteiner som är nödvändiga för mitokondriell funktion, varav resten kodas av kärn-DNA (nDNA). Det antas vanligen att mitokondrier härrör från en endosymbiotisk fusionshändelse mellan en alfa-proteobakteriell förfader och en förfäders eukaryota cell. När denna hypotetiska symbios ägde rum överfördes mitokondriernas genetiska information gradvis till kärnan under eoner, vilket förklarar den ovannämnda kompaktiteten hos mtDNA jämfört med genomerna hos moderna cyanobakterier2. En sådan överföring av gener bevisas starkast av förekomsten av långa sträckor av nDNA som är mycket homologa med sekvenserna som finns i mtDNA. Dessa nukleära mitokondriella sekvenser (NUMT) är en vanlig källa till feltolkning under genotypning, och vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas för att undvika nukleära fördomar vid genotypning mtDNA3 (figur 1A).
Ett annat särdrag hos mtDNA är att dess kopieringsnummer varierar beroende på celltyp, numrering var som helst från tiotusentals kopior per cell4. På grund av denna multi-copy natur kan mtDNA hysa ett brett spektrum av genotyper inom en enda cell, vilket kan resultera i en mer kontinuerlig distribution av alleler i motsats till de diskreta allelerna associerade med kärngener när man överväger kromosomernas zygositet. Denna heterogenitet av mitokondriella alleler kallas mitokondriell heteroplasmi, vilket typiskt uttrycks i procentuell prevalens av en given mutation som en andel av det totala mtDNA i en given cell. Heteroplasmi kan kontrasteras med homoplasmi, vilket hänvisar till en unik art av mtDNA som finns över en cell.
Mätning av mitokondriell heteroplasmi är av särskilt intresse vid kvantifiering av andelen mtDNA-molekyler som innehåller patogena varianter. Sådana varianter kommer i form av enkla nukleotidpolymorfismer (SNP), små indeler eller storskaliga borttagningar5. De flesta människor är heteroplasmatiska för patogena varianter; De uppvisar emellertid inga kliniska fenotyper, som ofta bara manifesterar sig vid högre heteroplasmatiska nivåer av patogent mtDNA i ett fenomen som kallas tröskeleffekt6. Medan värdena associerade med patogenicitet är starkt beroende av arten av den patogena mutationen och vävnaden i vilken den förekommer, ligger de vanligtvis över 60% heteroplasmi7.
Det finns flera forskningsområden där mitokondriell genotypning är vanligt. Inom det medicinska området kan testning eller kvantifiering av mtDNA-mutationer fungera som ett diagnostiskt kriterium för mitokondriella sjukdomar, varav många har mtDNA-avvikelser som ursprung5. Förutom studien av humana patogena mutationer kommer förekomsten av djurmodeller som innehåller patogena SNP i mtDNA sannolikt att öka, med tanke på den senaste tillkomsten av mitokondriell basredigering som möjliggjorts av mitokondriellt riktade DddA-härledda cytosinbasredigerare (DdCBE)8 och TALE-baserade deaminaser (TALED) för adeninbasredigering9. Detta tillvägagångssätt kommer att vara avgörande för att förstå samspelet mellan avvikande mitokondriella genotyper och de resulterande dysfunktionerna. Det pågår också vetenskaplig forskning om ombyggnad av mitokondriellt genom för ultimat användning som en terapeutisk strategi vid mänskliga mitokondriella sjukdomar via ett tillvägagångssätt som kallas heteroplasmiskiftning. Detta forskningsområde handlar främst om att rikta mutationsspecifika nukleaser till mitokondriell matris; Detta resulterar i preferensnedbrytning av patogent mtDNA, vilket leder till räddningar i fenotyp10,11,12,13. Alla experiment som involverar ombyggnad av mitokondriell genotyp kräver en robust kvantitativ metod för att bedöma heteroplasmiskift.
En mängd olika metoder används för att genotyp mtDNA, och dessa varierar beroende på mutationens natur. Nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) är mer exakta när det gäller att kvantifiera SNP i mtDNA; Dessa metoder förblir dock oöverkomligt dyra för rutinmässig kvantifiering av mitokondriell heteroplasmi, särskilt om antalet prover är litet. Sanger-sekvensering kan också möjliggöra detektering av SNP; Detta tillvägagångssätt är dock inte kvantitativt och misslyckas ofta med att upptäcka låga nivåer av heteroplasmi eller kan vara felaktigt vid uppskattning av höga heteroplasmier. Pyrosequencing, som en analys som involverar minimal förberedelse och möjliggör snabb kvantifiering av heteroplasmi för vilket mtDNA-prov som helst, föreslås som en lämplig kompromiss mellan dessa två ytterligheter. Denna metod har använts rutinmässigt för att kvantifiera mitokondriella SNP av många forskare i olika sammanhang, inklusive rättsmedicinsk analys 14,15, klinisk diagnos16 eller genotypning av mtDNA från enstaka celler17.
Denna analys innefattar ett första PCR-föramplifieringssteg av en region som flankerar SNP i mtDNA, vilket följs av en sekvenserings-för-syntesanalys med användning av en sträng av den tidigare genererade ampliconen. En av de två primrarna som används i föramplifieringssteget måste biotinyleras på 5′-änden, vilket gör det möjligt för pyrosequencing-apparaten att isolera den enda DNA-strängen som ska användas som mall för sekvenseringsreaktionen. En tredje sekvenseringsprimer glödgas sedan på den kvarhållna biotinylerade strängen, vilket möjliggör begynnande DNA-syntes som deoxinukleotider som ska dispenseras i en fördefinierad ordning i reaktionskammaren. Pyrosequencern registrerar mängden av varje bas som införlivas baserat på en självlysande avläsning, vilket möjliggör relativ kvantifiering av mitokondriella alleler av mutant och vildtyp vid DNA-syntes (figur 1B). Luminiscensen genereras av ett luciferasenzym, som avger ljus i närvaro av ATP som ett ATP-sulfurylas syntetiserar de novo vid varje inkorporeringshändelse från pyrofosfaterna som frigörs av varje nukleotid. Dessa två reaktioner kan sammanfattas enligt följande:
1. PPi (från nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP-sulfurylas)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + ljus (luciferas)
Att detektera adeninbaser av pyrosequencern utan att ATP korsreagerar med luciferas i den andra reaktionen är en utmaning. Detta löses emellertid genom att använda en adeninanalog för DNA-syntes, nämligen dATPαS. Trots att det inte är ett perfekt substrat för luciferas, producerar det en starkare luminiscens jämfört med de tre andra nukleotiderna, som justeras digitalt av pyrosequenceren och ställs in på en faktor 0,9. På grund av denna inneboende variabilitet föreslås att man undviker sekvensering av adenin vid SNP-positionen (se diskussionen för mer information).
Följande protokoll beskriver metoden för mtDNA-heteroplasmibedömning genom pyrosequencing och beskriver de nödvändiga försiktighetsåtgärderna vid utformningen av amplifieringsprimrarna för att undvika biologisk eller teknisk bias vid genotypning av SNP i mtDNA. Det senare innebär digital kartläggning och val av primeruppsättningar, optimering av förförstärknings-PCR och slutligen sekvensering och raffinering av analysen. Två tillämpade exempelanalyser demonstreras: för det första optimeringen av den vanligaste humana patogena varianten m.3243A>G18, och för det andra genotypningen av musembryonala fibroblastceller (MEF) som har genomgått heteroplasmiförskjutning med hjälp av teknik som utvecklats vid Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk aspekt för protokollets framgång är att undvika kontaminering, särskilt vid användning av små mängder utgångsmaterial. Det rekommenderas att använda en UV-huv och filtrerade pipettspetsar när proverna förbereds när det är möjligt, samt att hålla förförstärknings- och efterförstärkningsområdena åtskilda. Blankmätningar och prover av känd heteroplasmi (t.ex. vildtyps-DNA) bör alltid inkluderas för att användas som riktmärken för att kontrollera teknisk eller biologisk partiskhet. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Silvia Marchet och Constanza Lamperti (Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Fondazione IRCCS, Milano) för att ha förberett och tillhandahållit m.3243A>G cybridceller som används som illustrativa exempel för detta protokoll. Vi vill också erkänna medlemmarna i Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) för användbar diskussion under denna forskning. Detta arbete stöddes av kärnfinansiering från Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 och MC_UU_00028/3). P.A.N. och P.S.-P. stöds dessutom av The Lily Foundation respektive The Champ Foundation.
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
