في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.
يمكن للخلايا تغيير أشكالها بنشاط وتصبح متحركة ، وهي خاصية تعتمد على قدرتها على إعادة تنظيم بنيتها الداخلية بنشاط. تعزى هذه الميزة إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي الخلوي ، ولا سيما الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، ومحركات الميوسين ، والبروتينات الملحقة التي تظهر خصائص الانكماش الجوهري. الرأي المقبول عادة هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجة مرنة. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النموذج دائما تفسير النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع صورة تصف الهيكل الخلوي بأنه مادة نشطة مرنة مسامية – شبكة مرنة مدمجة مع العصارة الخلوية. تدفع تدرجات الانقباض الناتجة عن محركات الميوسين تدفق السيتوسول عبر مسام الجل ، مما يشير إلى أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مرتبطة بإحكام. تتمثل إحدى السمات الرئيسية لمرونة المسام في الاسترخاء المنتشر للضغوط في الشبكة ، والتي تتميز بثابت انتشار فعال يعتمد على معامل مرونة الهلام ، والمسامية ، ولزوجة السيتوسول (المذيبات). نظرا لأن الخلايا لديها العديد من الطرق لتنظيم بنيتها وخواص المواد ، فإن فهمنا الحالي لكيفية اقتران ميكانيكا الهيكل الخلوي وديناميكيات تدفق السيتوسول لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. هنا ، يتم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لتوصيف الخصائص المادية لجل actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي. الانكماش الهلامي مدفوع بانقباض محرك الميوسين ، مما يؤدي إلى ظهور تدفق المذيب المخترق. تصف الورقة كيفية تحضير هذه المواد الهلامية وإجراء التجارب. نناقش أيضا كيفية قياس وتحليل تدفق المذيبات وتقلص الهلام على المستويين المحلي والعالمي. يتم إعطاء علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة ، بما في ذلك صلتها بميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.
الخلايا الحية لها خصائص ميكانيكية فريدة. إلى جانب القدرة على الاستجابة السلبية للقوى المطبقة ، فهي أيضا قادرة على توليد القوى بنشاط استجابة للمنبهات الخارجية1. تعزى هذه الخصائص ، الضرورية لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، لا سيما أثناء حركة الخلية ، في المقام الأول إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي للخلية ، وخاصة الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، والمحركات الجزيئية للميوسين ، والبروتينات الملحقة. تظهر شبكات الأكتوميوسين هذه خصائص ذاتية التنظيم والانكماش الجوهرية مدفوعة ببروتينات الميوسين الحركية ، والتي تربط خيوط الأكتين وتولد بنشاط ضغوطا ميكانيكية في الشبكة التي يغذيها التحلل المائي ATP2.
أجريت العديد من الدراسات التجريبية والنظرية لدراسة الخصائص المادية للهيكل الخلوي3. الرأي المقبول عموما هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجةمرنة 4. هذا يعني أنه على نطاقات زمنية قصيرة ، يتصرف الهيكل الخلوي كمادة مرنة ، وعلى فترات زمنية طويلة ، يتصرف كسائل لزج بسبب البروتينات المتشابكة وانفصال محرك الميوسين (وإعادة الارتباط) ، مما يسمح للشبكة بالدوران ديناميكيا. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، لا يمكن للنموذج اللزج المرن وصف النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع الصورة التي تصف الهيكل الخلوي ، وبشكل عام ، سيتوبلازم الخلية الذي يوصف بأنه مادة فعالة مساميةمرنة 5,6. ميزتان رئيسيتان تميزان هذه الأنواع من المواد. (ط) السمة الرئيسية الأولى هي توليد تدفق السيتوسول المخترق (“المذيب”) عبر مسام الهلام عن طريق تدرجات انقباضية مدفوعة بمحركات الميوسين ، والتي تكمن وراء عمليات مثل تفجير الخلية7 ، والحركة8 ، وتذبذبات شكل الخلية9. يمكن أن يكون ظهور مثل هذه التدفقات الخلوية محليا ، أو للنفخ ، أو عالميا ، كما هو الحال في حركة الخلية. في الحالة الأخيرة ، تدفع الضغوط المطبقة بالانقباض في مؤخرة الخلية تدفق السائل الخلوي نحو مقدمة الخلية ، والتي تغذي تجمع البروتين اللازم لتجميع الصفيحة8. (ii) الميزة الرئيسية الثانية هي أن استرخاء الإجهادات منتشر ويتميز بثابت انتشار فعال ، والذي يعتمد على معامل مرونة الهلام ، ومسامية الهلام ، ولزوجة المذيب5. يحدد ثابت الانتشار المسامي المرن مدى سرعة استجابة النظام للإجهاد المطبق. تتوافق ثوابت الانتشار الأعلى مع إعادة توزيع الإجهاد بشكل أسرع. وهذا بدوره يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة توزيعه داخل الخلية بعد الضغط الميكانيكي المطبق، سواء كان خارجيا أو داخليا، مثل الضغوط الانقباضية النشطة الناتجة عن محركات الميوسين. وبالتالي ، توضح هذه الأمثلة أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مقترنة بإحكام ولا يمكن معالجتها بشكل منفصل3.
نظرا لأن الخلايا يمكنها تنظيم خواصها الميكانيكية بعدة طرق ، فإن التفاعل بين ميكانيكا الشبكة وديناميكيات تدفق السوائل لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. يتمثل النهج البديل القوي في استخدام الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تسمح بالتحكم الكامل في المكونات المجهرية المختلفة ومعلمات النظام ، مما يجعل هذه الأنظمة النموذجية مثالية للتحليل المادي10,11. تم استخدام هذا النهج بنجاح لدراسة تأثير تركيب البروتين وهندسة النظام على الحركة القائمة على الأكتين 12،13،14،15،16،17،18 ، والنمط ثنائي الأبعاد لشبكات الأكتوميوسين 19،20،21،22، والتفاعل بين انقباض الشبكة وديناميات تدفق السوائل لجل الأكتوميوسين المرن ، وهو محور هذه الورقة23.
في هذه المخطوطة ، تمت مناقشة إعداد شبكات الأكتوميوسين المرنة المقلصة ذات الأبعاد التي يمكن التحكم فيها وخصائص المواد بناء على عمل Ideses et al.23. يتم تحليل ديناميكيات الجل المتعاقد والمذيب المصفى وقياسها ، والتي من خلالها يتم إثبات أن هذه المواد الهلامية actomyosin يمكن وصفها بأنها مادة فعالة poroelastic. تؤكد دراسة تأثير لزوجة المذيبات على انتشار الإجهاد الطبيعة المسامية لهذه الشبكات. يتم توفير علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهمية النتائج التجريبية للهيكل الخلوي الخلوي.
هنا ، يتم استخدام نهج في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي ، وبشكل أعم ، من السيتوبلازم الخلوي ، الذي ثبت أنه يتصرف كمادة مساميةمرنة 3,5. تتميز ريولوجيا الهيكل الخلوي الخلوي (السيتوبلازم) بثابت انتشا?…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر دينا أرانوفيتش على تنقية البروتين ووضع العلامات. G.L. ممتن لوزارة العلوم والتكنولوجيا والفضاء الإسرائيلية لمنحة جابوتنسكي للدكتوراه. تعرب A.B.G. عن امتنانها لمؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 2101/20) ولوزارة العلوم والتكنولوجيا – دولة إسرائيل (منحة 3-17491) للدعم المالي.
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
Oven | WTC Binder | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |