Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64377
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

Summary

Bu çalışmada, kontrollü koşullar altında aktomiyosin jellerinin poroelastisitesini incelemek için in vitro rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Aktomiyosin jelinin ve gömülü çözücünün dinamikleri, ağ poroelastisitesinin gösterildiği şekilde ölçülür. Ayrıca deneysel zorlukları, ortak tuzakları ve hücre hücre iskeleti mekaniği ile olan ilgisini tartışıyoruz.

Abstract

Hücreler şekillerini aktif olarak değiştirebilir ve iç yapılarını aktif olarak yeniden düzenleme yeteneklerine bağlı bir özellik olan hareketli hale gelebilir. Bu özellik, hücre hücre iskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine, özellikle de polar aktin filamentlerinin, miyozin motorlarının ve içsel kasılma özellikleri sergileyen aksesuar proteinlerin aktif bir jeli olan aktomiyozin hücre iskeletine atfedilir. Genellikle kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir malzeme gibi davranmasıdır. Bununla birlikte, bu model, hücre iskeletini poroelastik bir aktif materyal olarak tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları her zaman açıklayamaz - sitosol ile gömülü elastik bir ağ. Miyozin motorları tarafından üretilen kontraktilite gradyanları, sitosolün jel gözenekleri boyunca akışını yönlendirir, bu da sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığı sonucuna varır. Poroelastisitenin ana özelliklerinden biri, jel elastik modülüne, gözenekliliğine ve sitosol (çözücü) viskozitesine bağlı etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilen, ağdaki streslerin difüzif gevşemesidir. Hücrelerin yapılarını ve malzeme özelliklerini düzenlemenin birçok yolu olduğu için, sitoiskelet mekaniğinin ve sitosol akış dinamiklerinin nasıl birleştiğine dair mevcut anlayışımız tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin materyal özelliklerini hücre hücre iskeleti için bir model sistem olarak karakterize etmek için in vitro bir rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmaktadır. Jel büzülmesi, nüfuz eden çözücünün akışının ortaya çıkmasına neden olan miyozin motor kontraktilitesi tarafından tahrik edilir. Makale, bu jellerin nasıl hazırlanacağını ve deneylerin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, solvent akışının ve jel büzülmesinin hem yerel hem de küresel ölçekte nasıl ölçüleceğini ve analiz edileceğini tartışıyoruz. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçekleme ilişkileri verilmiştir. Son olarak, deneysel zorluklar ve ortak tuzaklar, hücre hücre iskeleti mekaniği ile ilgileri de dahil olmak üzere tartışılmaktadır.

Introduction

Canlı hücreler benzersiz mekanik özelliklere sahiptir. Uygulanan kuvvetlere pasif olarak tepki verme yeteneğinin yanı sıra, dış uyaranlara yanıt olarak aktif olarak kuvvet üretme yeteneğine de sahiptirler1. Özellikle hücre hareketliliği sırasında çeşitli hücresel süreçler için gerekli olan bu özellikler, öncelikle hücre hücre iskeletinin, özellikle polar aktin filamentlerinin, miyozin moleküler motorlarının ve aksesuar proteinlerinin aktif bir jeli olan aktomiyozin sitoiskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine atfedilir. Bu aktomiyosin ağları, aktin filamentlerini çapraz bağlayan ve ATP hidrolizi2 tarafından beslenen ağda aktif olarak mekanik stresler üreten miyozin motor proteinleri tarafından tahrik edilen içsel öz-organizasyon ve büzülme özellikleri sergiler.

Hücre iskeletinin malzeme özelliklerini incelemek için çok sayıda deneysel ve teorik çalışma yapılmıştır3. Yaygın olarak kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir materyal gibi davrandığı yönündedir4. Bu, kısa zaman ölçeklerinde, hücre iskeletinin elastik bir malzeme gibi davrandığı ve uzun zaman ölçeklerinde, çapraz bağlama proteinleri ve miyozin motor dekolmanı (ve yeniden bağlanması) nedeniyle viskoz bir sıvı gibi davrandığı anlamına gelir. ağın dinamik olarak dönmesini sağlar. Bununla birlikte, birçok durumda, viskoelastik model, hücre iskeletini ve daha genel olarak, poroelastik aktif madde 5,6 olarak tanımlanan hücre sitoplazmasını tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları tanımlayamaz. Bu tür malzemeleri karakterize eden iki ana özellik vardır. (i) İlk ana özellik, hücre kanaması7, motilitesi8 ve hücre şekli salınımları9 gibi işlemlerin altında yatan miyozin motorları tarafından tahrik edilen kontraktilite gradyanları tarafından jel gözenekleri boyunca nüfuz eden sitosol ("çözücü") akışının oluşturulmasıdır. Bu tür sitozolik akışların ortaya çıkışı, hücre hareketliliğinde olduğu gibi lokal, blebbing için veya küresel olabilir. İkinci durumda, hücre arkasındaki kontraktil uygulanan gerilmeler, sitozolik sıvının akışını hücre önüne doğru yönlendirir ve bu da lamellipodia montajı8 için gerekli protein havuzunu doldurur. (ii) İkinci ana özellik, gerilmelerin gevşemesinin difüzif olması ve jel elastik modülüne, jel gözenekliliğine ve çözücü viskozitesine bağlı olan etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilmesidir5. Poroelastik difüzyon sabiti, sistemin uygulanan bir gerilime ne kadar hızlı tepki verdiğini belirler. Daha yüksek difüzyon sabitleri, daha hızlı gerilim yeniden dağılımına karşılık gelir. Bu da, hücre içi sitozolik sıvının, miyozin motorları tarafından üretilen aktif kontraktil stresler gibi harici veya dahili olsun, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içinde yeniden dağıtılmasının ne kadar süreceğini belirler. Bu nedenle, bu örnekler, sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığını ve ayrı ayrı tedavi edilemeyeceğini göstermektedir3.

Hücreler mekanik özelliklerini çeşitli şekillerde düzenleyebildiklerinden, ağ mekaniği ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim tam olarak anlaşılamamıştır. Güçlü bir alternatif yaklaşım, çeşitli mikroskobik bileşenlerin ve sistem parametrelerinin tam kontrolüne izin veren in vitro yeniden yapılandırılmış sistemlerin kullanılmasıdır ve bu da bu model sistemleri fiziksel analiz için en uygun hale getirir10,11. Bu yaklaşım, protein bileşiminin ve sistem geometrisinin aktin bazlı motilitesi 12,13,14,15,16,17,18, aktomiyosin ağlarının 2D modellemesi 19,20,21,22 üzerindeki etkisini incelemek için başarıyla kullanılmıştır ve bu makalenin odak noktası olan poroelastik aktomiyosin jellerinin ağ kontraktilitesi ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim23.

Bu yazıda, kontrol edilebilir boyutlara ve malzeme özelliklerine sahip kontraktil elastik aktomiyosin ağlarının hazırlanması, Ideses ve ark.23'ün çalışmalarına dayanarak tartışılmıştır. Sözleşme jelinin ve boşaltılmış çözücünün dinamikleri analiz edilir ve ölçülür, bu sayede bu aktomiyosin jellerinin poroelastik bir aktif madde olarak tanımlanabileceği gösterilmiştir. Solvent viskozitesinin stres difüzyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi, bu ağların poroelastik doğasını daha da doğrulamaktadır. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçeklendirme ilişkileri sağlanır. Son olarak, deneysel zorluklar, ortak tuzaklar ve deneysel sonuçların hücre hücre iskeleti ile ilgisi de tartışılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cam yüzey işleme ve pasivasyon:

NOT: Bu bölüm üç ana adımı içermektedir (bkz. Şekil 1): (i) temizleme ve hidrofilizasyon, (ii) silinizasyon ve (iii) yüzey pasivasyonu.

  1. Temizleme ve hidrofilizasyon
    1. Cam yüzey temizliği için Piranha solüsyonunu kullanın.
      NOT: Piranha çözeltisi% 30 H2 O2 ve% 70 H2 S04(Malzeme Tablosu) karışımıdır. Başlıca amacı, kapak kayması yüzeylerinden organik kontaminasyonları gidermek ve cam yüzeydeki OH gruplarını açığa çıkarmaktır. Bu şekilde, cam yüzey hidrofilik hale gelir.
    2. Ev yapımı bir politetrafloroetilen tutucuya (taban alanı: 5,5 cm x 5,5 cm) 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) cam kapak fişleri (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Politetrafloroetilen tutucuyu 400 mL'lik bir beher içine aktarın (Malzeme Tablosu) ve 2 saat boyunca 300 mL Piranha çözeltisi ile inkübe edin. Bu adımı buz üzerinde ve kimyasal bir başlıkta yapın.
      NOT: Tutucu tabanına vidalanan politetrafloroetilen direk, 12 cm uzunluğundadır ve beherden (11 cm) daha uzundur, bu da tutucunun Piranha çözeltisine / içinden güvenli bir şekilde aktarılmasını/çekilmesini sağlar. Piranha çözeltisi hala oldukça reaktif ve çok sıcak olabileceğinden, reaksiyonu durdurmak zorunludur. Reaksiyonu durdurmanın en kolay yolu, Piranha çözeltisini (en azından) 50x seyreltme elde etmek için (musluk) suyuna dökmektir. Çözelti daha sonra güvenli bir şekilde atılabilir. Kullanılmış Piranha çözeltisini asla kapalı bir cam şişede tutmayın – bu bir şişe patlamasıyla sonuçlanabilir.
    3. Politetrafloroetilen tutucuyu, fazla Piranha'yı kapaklardan yıkamak için taze çift damıtılmış su (DDW) ile doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın.
    4. Beheri bir sonikasyon banyosuna (Malzeme Tablosu) aktarın ve 80 ° C'de 10 dakika boyunca tam güçte 25 Hz'de sonikleştirin. Bu adımı yeni DDW ile iki kez daha tekrarlayın. Her seferinde yeni DDW kullanın.
  2. Silanizasyon
    1. Tutucuyu 300 mL saf metanol (Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş temiz bir beher (400 mL) ve daha sonra bir sonikasyon banyosuna (Malzeme Tablosu) aktarın. 80 ° C'de 30 dakika boyunca tam güçte 25 Hz'de sonikasyon.
    2. Sonikasyondan sonra, tutucuyu 15 mL DDW, 3.1 mL asetik asit (Malzeme Tablosu), 340 mL metanol ve 7.6 mL silan ((3-Merkaptopropil) trimetoksisilan (Malzeme Tablosu) kullanılarak hazırlanan bir silan çözeltisine aktarın. Beheri parafilmle kapatın ve gece boyunca buzdolabında 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Silan çözeltisinin hazırlanması ve işlenmesi kimyasal bir davlumbazda yapılmalıdır. Silanizasyon adımından sonra, kullanılan silan çözeltisini (atık) kimyasal başlık içindeki özel bir cam şişeye koyun.
    3. Ertesi gün, tutucuyu 15 s boyunca 300 mL saf metanol ile doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın. Daha sonra, fazla metanolü gidermek için politetrafloroetilen tutucunun tabanını kurutmadan önce tutucuyu temiz bir beher içine aktarın. Cam kapakları 120 ° C'de 5 dakika kurutmak için beheri fırına (Malzeme Tablosu) aktarın.
  3. İnert polimer ile yüzey pasivasyonu
    1. Cam kapakları inert bir polimerle inkübe ederek yüzey pasivasyonu elde edin (Malzeme Tablosu). Her deney için, iki kapak parçası alın ve bunları başlangıçta etanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) ile temizlenmiş bir parafilm tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin (Malzeme Tablosu).
    2. Her bir kapak kaymasını, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (PBS) (Malzeme Tablosu) içinde 1 saat boyunca 1 saat boyunca 4 mg · mL − 1 5 kDa moleküler ağırlıklı metoksi polietilen glikol maleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Malzeme Tablosu) (Malzeme Tablosu) ile inkübe edin.
      NOT: Kapakların hidrofobik bir parafilm tabakası üzerine yerleştirilmesi, hidrofilik PEG polimer çözeltisini cam kapak kayması yüzeyine sınırlar. Kuluçka süresi, optimum pasivasyon elde etmek için kritik öneme sahiptir. 45 dakika ile 2 saat arasında değişen inkübasyon süreleri kullanın. Bu inkübasyon süresinin üstünde, cam örtü kayma yüzeyi bozulabilir, bu da protein yapışmasına ve şeffaflık kaybına neden olabilir.
    3. Kuluçka işleminin sonunda, her bir kapağı 5 mL DDW ile durulayın veN2 (gaz) akışı ile kurutun. Kapakları vakum altında kurutmayın. Pasivasyondan sonra kapakların ıslak tutulması gerektiğinden, pegile yüzeylere derhal 1 mL 10 mM Tris koyun. Kapak fişlerini 2 saat içinde kullanın.
      NOT: Cam yüzey kontaminasyonunu önlemek için çeşitli adımlar laminer akış odasında gerçekleştirilmelidir.

2. Protein saflaştırma

  1. Jel filtrasyon yöntemi24'ü kullanarak G-aktin'i tavşan iskelet kası aseton tozundan arındırın.
    1. Aktin saflaştırma 1 hafta sürer. Saflaştırılmış G-aktin'i G-tamponunda tutun (5 mM Tris pH 7.8,% 0.01 NaN3, 0.1 mM CaCl 2,0.2 mM ATP ve 1 mM DTT) ve buz üzerinde saklayın. Çözeltiyi 2 hafta içinde kullanın.
      NOT: Buzu birkaç günde bir değiştirin.
    2. Aktin'i maleimidle modifiye edilmiş floresan boya16 (Malzeme Tablosu) ile etiketleyin. GST-fascin'i Ono ve ark.25 yöntemine dayanarak saflaştırın. Her iki proteini de sıvıN2'de flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  2. Miyozin II'yi tavşan iskelet kasından arındırmak için standart bir protokol kullanın26. Saflaştırılmış miyozin II (dimer) stok tamponu 10 mM Tris pH 7.4, 0.5 M KCl ve %35 w/v sakkaroz içerir. Miyozini sıvı N2'de flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Yüksek KCl konsantrasyonu, miyozin motorlarını dimerik bir formda tutarken, yüksek sakkaroz yüzdesi, donma sırasında motorların aktivitesinin engellenmemesini sağlar. Miyozin II stok çözeltileriyle çalışırken viskoz sıvı elleçlemesi için özel bir pipet kullanın (Malzeme Tablosu).
    1. Miyozin II dimerlerini, mühendislik sistein kalıntıları çiftlerinde floresan bir boya (Malzeme Tablosu) ile etiketleyin19,27. Bu amaçla bir tavuk gizzard RLC mutant A kullanın26. Etiketli miyozin II'yi sıvıN2'de flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu etiketleme prosedürü, etiketli miyozinin doğal miyozin II proteini olarak aktif olmasını sağlar.
  3. Stok protein çözeltilerinin emilimini ölçmek için bir UV-Vis spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanın ve aşağıdaki yok olma katsayılarını kullanarak Beer-Lambert yasası ile protein konsantrasyonlarını çıkarın: G-aktin (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), miyozin II dimer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), ve RLC mutant A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.

3. Numune hazırlama

NOT: Aktin monomerlerini, makroskopik olarak kontraktil elastik aktomiyosin ağları üretmek için büyük miyozin II motorlarının agregalarının ve güçlü pasif çapraz bağlayıcı fasisinin varlığında polimerize edin 19,23. Çözeltiye floresan boncukların eklenmesi, jel büzülmesi sırasında çözücü akışının izlenmesini sağlar.

  1. Protein ("aktomiyosin") çözeltisi
    1. G-aktin hariç, proteinleri küçük alikotlarda -80 ° C'de tutun ve kullanmadan önce 37 ° C'de çözün. Aktomiyosin çözeltisinin toplam hacmi 40 μL'dir.
    2. 10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, bir ATP yenileyici sistem (0.5 mg·mL−1 kreatin kinaz ve 5 mM kreatin fosfat), 200 μM EGTA (şelatlarCa2+ iyonları), bir anti-ağartma çözeltisi (0.1 mg·mL−1 glikoz oksidaz, 0.018 mg·mL−1 katalaz ve 5 mg·mL−1 glikoz) karıştırarak çözeltiyi hazırlayın, 5 μM G-aktin, 280 nM GST-fasin ve 1.67 nM miyozin II. Etiketli G-aktin'in yüzdesi% 5'tir (molar yüzde).
      NOT: Jel büzülmesinin ileri aşamalarında floresan sinyalinin doygunluğunu önlemek için düşük oranda etiketli G-aktin kullanın.
  2. Miyozin II motor agregalarının hazırlanması
    1. Miyozin motorlarını protein çözeltisine agrega şeklinde ekleyin. Büyük miyozin agregaları (150 miyozin dimerleri/agregası) oluşturmak için, 25 mM KCl'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için miyozin stok çözeltisini 10 mM Tris pH 7.4 ile seyreltin.
    2. Seyreltilmiş miyozin çözeltisini oda sıcaklığında (RT) 10 dakika bekletin ve kullanana kadar buza aktarın. Motorlar 2 saate kadar tamamen aktiftir.
  3. Solvent akışının ölçülmesi
    1. Jel gözenekleri boyunca çözücü akışını izlemek için, floresan boncukları aktomiyosin çözeltisine ekleyin. Boncukları pasifleştirerek boncuklar ve aktomiyosin ağı arasındaki etkileşimi azaltın. Pratik olarak, RT'de 20 dakika boyunca 5 μM G-aktin ile 1 μL boncuk (Malzeme Tablosu) inkübe edin ve daha sonra santrifüjleme (Malzeme Tablosu) ile fazla G-aktin'i çıkarın (koşullar: 4 ° C'de 5 dakika boyunca 6.000 x g ).
    2. Kalan kaplanmamış yüzeyi (muhtemelen) bloke etmek için bu adımı 10 mg · mL − 1 sığır serum albümini (BSA) (Malzeme Tablosu) ile tekrarlayın. Boncukları deneylerde 1:10.000 vol/vol son seyreltmede kullanın.
      NOT: Boncukların çapını, boncuk/gözenek boyutu oranı her aşamada <1 olacak şekilde jel gözenek boyutuna uyarlamak önemlidir.
  4. Çözelti viskozitesinin etkisi
    1. Aktomiyosin çözeltisine gliserol (Malzeme Tablosu) ekleyerek çözeltinin viskozitesini kontrol edin. % 0 ila% 34 arasında değişen bir ağırlık yüzdesinde gliserol eklenmesi, çözelti viskozitesinde η ω ila 2.76 η ω arasında karşılık gelen bir artışa neden olur, burada η ω, 20 ° C'de suyun viskozitesidir28.
      NOT: Gliserol ile çalışırken viskoz sıvı elleçlemesi için özel bir pipet kullanmak önemlidir (Malzeme Tablosu).

4. Deneme çalıştırma

  1. Ev yapımı numune tutucu elleçleme
    1. PEG pasifleştirilmiş kapaklardan birini alın, üzerine yağlanmış bir parafilm ara parçası yerleştirin ve numune tutucuya yerleştirin.
      NOT: Parafilm ara parçası herhangi bir ara parça ile değiştirilebilir.
  2. Aktomiyosin çözeltisinin hazırlanması
    1. Çeşitli mikroskobik bileşenleri birleştirerek, miyozin II motor agregalarını ekleyerek ve en son EGTA'yı ekleyerek bir mikrosantrifüj tüpünde buz üzerinde aktomiyosin çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi iyice karıştırın. EGTA'nın eklenmesi, deneyin başlangıç zamanını belirleyen aktomiyosin ağı polimerizasyonunu başlatır.
  3. Bu çözeltinin 1,1 μL'sini tutucuya monte edilmiş kapak kapağına koyun ve ikinci kapak kapağını üstüne yerleştirin. Numuneyi kapatmak için tutucuyu vidalayın. Bu işlem, disk benzeri bir şekil alan damlayı hafifçe sıkar. Düşme çapları 2.800-3.000 μm arasında değişmektedir.
  4. Numune tutucuyu mikroskop üzerine yerleştirin ve alımı başlatın. İlk edinme süresini azaltmak için mikroskobu önceden hazırlayın. Numune görüntülemeye başlamak için karıştırmadan sonra genellikle 1-2 dakika sürer.

5. Mikroskopi teknikleri

  1. Özel bir yazılım (Malzeme Tablosu) tarafından kontrol edilen ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (Malzeme Tablosu) kullanarak numuneleri görüntüleyin.
    1. Tüm jel alanını görselleştirmek ve zamanla makroskopik büzülmesini takip etmek için 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR hedefinin (Malzeme Tablosu) düşük büyütmelerini kullanın.
    2. Ağ gözenekliliğini ve yapısını karakterize etmek ve ağın kendi kendine örgütlenmesini ve zamanla daralmasını takip etmek için 10x/0.3 Ph1 UPlanFL hedefi (Malzeme Tablosu) kullanın.
      NOT: Bu hedef, ağ içindeki miyozin II motor agregalarının lokalize edilmesi ve floresan boncukların jel gözenekleri boyunca hareketinin takip edilmesi için de yararlıdır. Daha yüksek büyütmeler, çift renkli görüntüleme modunda (Malzeme Tablosu) daha da önemli olan azaltılmış bir görüş alanı pahasına kullanılabilir.
  2. Numuneleri 488 nm (aktin/floresan boncuklar) ve 561 nm (miyozin motor agregaları/floresan boncuklar) sıcaklıklarında heyecanlandırın. Elektron çarpan yük bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera (Malzeme Tablosu) ile akış modunda özel bir yazılımla (Malzeme Tablosu) kare başına 100 ms'de görüntüleri elde edin.
    NOT: Floresan lamba (Malzeme Tablosu) yoğunluğu, şebeke daralması sırasında sinyal doygunluğunu önlemek için mümkün olan en düşük değerde tutulmalıdır.
  3. Aynı anda iki renkli görüntüleme
    1. Bu modu iki amaç için kullanın: (i) aktin ağı içindeki miyozin motor agregalarının lokalizasyonunu tespit etmek ve (i) ağ büzülmesi sırasında içerideki ve dışarıdaki dışa doğru çözücü akışını karakterize etmek.
    2. Aktin ve miyozin II motorlarını sırasıyla 488 nm ve 561 nm'de heyecanlandırın ve görüntüleri aynı anda çift emisyonlu bir cihaz (Malzeme Tablosu) kullanarak bir EMCCD kameraya (Malzeme Tablosu) kaydedin. Aktin jelini (488 nm) ve floresan boncukları (561 nm) aynı anda görüntülemek için aynı görüntüleme sistemini kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deney başına iki cam kapak fişi kullanılır. Cam kapaklar PEG polimerleri ile temizlenir ve pasifleştirilir. Pasivasyon, çözünür proteinlerin erken deneysel aşamalarda cam yüzeylere yapışmasını önlemek ve sözleşme ağının cam duvarlarla etkileşimini en aza indirmek için gereklidir. İyi pasivasyon elde edilememesi verimsiz büzülmeye yol açabilir ve aşırı durumlarda aktin ağı oluşumunu bile engelleyebilir.

Şekil 1, yüzey işleme prosedürünün üç ana adımını açıklamaktadır. Bu adımlar aşağıdakileri içerir: (i) örtü kayması yüzeylerinden organik kontaminasyonu gideren ve cam yüzeydeki OH gruplarını açığa çıkaran bir Piranha çözeltisi kullanılarak yüzey temizliği ve hidrofilizasyon; (ii) (3-Merkaptopropil)trimetoksisilan ile yüzey silanizasyonu, her bir silan molekülünün bir SH grubu ile sona erdiği cam yüzeye kovalent olarak bağlamayı amaçlamaktadır; (iii) PEG polimerleri ile pasivasyon (mPEG-mal, 5 kDa)-Bu adımda, PEG polimerinin maleimid grubu, (3-Merkaptopropil)trimetoksisilan üzerindeki SH grubu ile kovalent olarak etkileşime girerek cam yüzeyde bir PEG tek katmanının oluşmasına neden olur.

Piranha arıtımı ve silinizasyonu için, 10-12 cam kapak fişi #1.5 (22 mm x 22 mm) bir politetrafloroetilen tutucuya yerleştirilir (Şekil 2A) ve bu tutucu 400 mL'lik bir behere aktarılır. Pasivasyon adımı için, parafilm kaplı bir Petri kabına iki cam örtü parçası aktarılır (Şekil 2B). Kapakların hidrofobik bir parafilm tabakası üzerine yerleştirilmesi, hidrofilik PEG polimer çözeltisinin inkübasyon süresi boyunca cam yüzeyle sınırlı kalmasını sağlar. Her bir kapak kayması, 22 ° C'de 1 saat boyunca 1x PBS'de 1 mL 4 mg · mL−1 5 kDa mPEG-mal ile inkübe edilir (Şekil 2B). Bu PEG polimer moleküler ağırlığı ve konsantrasyonu için, cam pasivasyonu, her bir PEG polimerinin mantar benzeri bir konformasyonda olduğu bir PEG monokatmanının oluşumuna yol açar29. Kuluçka işleminin sonunda, her bir kapak kayması 5 mL DDW ile durulanır veN2 (gaz) akışı ile kurutulur. Kapaklar hemen kullanılmazsa, kapak kayma yüzeylerini ıslak tutmak için pegile edilmiş yüzeylere 1 mL 10 mM Tris konulmalıdır. Kapaklar, bir deneye başlamadan hemen önce birN2 (gaz) akışı ile kurutulur. Kapakları 2 saat içinde kullanmak daha iyidir.

Makroskopik olarak kontraktil elastik aktomiyosin ağları, 5 μM G-aktin'in, büyük agregalar (~ 150 miyozin dimerleri / agregaları) ve 280 nM güçlü çapraz bağlayıcı fasin şeklinde eklenen 16.7 nM miyosin ile karıştırılmasıyla oluşturulur. Çözüm, bir ATP yenileyici sistem ve bir anti-ağartma çözeltisi kullanılarak sabit tutulan 1 mM ATP içerir (protokol bölümündeki ayrıntılara bakın). Delici çözücünün akışını analiz etmek için, aktomiyosin çözeltisine floresan boncuklar eklenir.

Deneyler, standart bir mikroskop aşamasının boyutlarına uyan ev yapımı bir numune tutucuda yürütülür (Şekil 3). İki PEG pasifleştirilmiş kapak fişinden birine h (~ 150 μm) kalınlığında yağlanmış bir parafilm ara parçası yerleştirilir ve bu kapak kayması numune tutucuya yerleştirilir (Şekil 3A). Daha sonra, aktomiyosin çözeltisi, çeşitli mikroskobik bileşenleri içererek, en son G-aktin, miyozin agregaları ve daha sonra aktin polimerizasyonunu tetikleyen EGTA eklenerek bir mikrosantrifüj tüpünde buz üzerinde hazırlanır. Çözelti iyi karıştırılmalıdır - bu, deneylerin başlangıç zamanını ayarlar (t = 0). Hemen, bu çözeltinin 1,1 μL'si kapak kaymasına yerleştirilir (Şekil 3B), ikinci PEG pasifleştirilmiş örtü kayması üzerine yerleştirilir (Şekil 3C) ve tutucu, aralarındaki damlayı sınırlamak için vidalanır (Şekil 3D). Bu damla hacmi ve ara parça tipi için, damla çapı yaklaşık 3.000 μm'dir, ancak araştırmacılar bu tahmini değerlere güvenmemelidir. Gerçek damla kalınlığı ve çapı her zaman doğrudan mikroskopi görüntülerinden ölçülmelidir. Kalınlık için konfokal mikroskop kullanılmalıdır.

Numune tutucu mikroskop üzerine yerleştirilir ve edinim başlatılır. Mikroskop, edinime başlama süresini en aza indirmek için önceden hazırlanmalıdır. Numune görüntülemeye başlamak genellikle 1-2 dakika sürer. Numuneler 488 nm ve/veya 561 nm'de uyarılır ve özel bir yazılım tarafından kontrol edilen ters çevrilmiş floresan mikroskop kullanılarak görüntülenir. Görüntüler, EMCCD kamera ile akış modunda kare başına 100 ms (veya daha az) bir hızda alınmalıdır. Aktin ağını ve miyozin motor agregalarını veya çözeltideki floresan boncukları aynı anda görüntülemek için, çift emisyonlu bir sistem kullanılmalıdır. Ağ daralmasının ileri aşamalarında sinyal doygunluğunu önlemek için floresan lambanın yoğunluğu mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır.

2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR hedefi, jelin yanal büzülme dinamiklerini ve jelin uzunluk ölçeğindeki akışkan akış yönlülüğünü ve hızını karakterize etmek için kullanılır. Bunlar, jel radyal (yanal) büzülme hızının çıkarılabildiği zamanla jel yarıçapındaki değişiklikleri takip etmek için yararlı olan düşük çözünürlüklü görüntülerdir. Ağın yapısını ve gözenekliliğini, miyozin motor agregalarının ağ içindeki yerini ve bireysel floresan boncukların jel gözenekleri boyunca hareketini çözmek için daha yüksek büyütme hedefleri kullanılmalıdır (örneğin, 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL hedefi). Daha yüksek büyütmeler de kullanılabilir, ancak çift renkli görüntüleme modu kullanıldığında daha önemli olan azaltılmış bir görüş alanı pahasına. (2D) floresan mikroskopi verileri, kasılma dinamiklerini hem lateral hem de dikey yönlerde karakterize etmek için kasılma jelinin 3D olarak konfokal görüntülenmesi ile tamamlanmalıdır. Konfokal mikroskopi, iki kapak kayması arasındaki boşluğu ölçmek için kullanılır - bu mesafe ilk jel kalınlığını tanımlar. Ek olarak, jelin kalınlığı, mekanik olarak kararlı bir durum elde edildiğinde deneyin sonunda ölçülmelidir.

Aktomiyosin ağlarının poroelastik bir malzeme gibi davrandığını göstermek için çeşitli kriterlerin yerine getirilmesi gerekir: (i) ağ, elastik bir malzeme gibi davrandığı sonucuna varacak şekilde yeniden şekillenmez (Şekil 4), (ii) jel gözenekleri boyunca su (çözücü) akışı miyozin kontraktilitesi tarafından yönlendirilir (Şekil 5) ve (iii) elastik stres gevşemesi etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilir, Jel etkili elastik modüle, κ'ye ve hareketli çözücü ile jel gözenekleri arasındaki sürtünmeyi açıklayan etkili sürtünme sabiti γ'ye bağlı olan D ~ κ / γ (Şekil 6). Aşağıda, her bir kriteri ayrı ayrı tartışıyoruz ve mevcut sistemde nasıl yerine getirildiklerini gösteriyoruz.

Amaç (i)

Öncelikle jel yapısı ve gözenekliliği analiz edilmeli, ağın dinamik olarak yeniden şekillenip şekillenmediği belirlenmelidir. Aktomiyosin ağının şematik bir gösterimi Şekil 4A'da gösterilmiştir. Ağ oluşumu, aktin filamentlerinin spontan nükleasyonu ve polimerizasyonu ile başlar ve daha sonra demet haline gelir (Şekil 4B). Ağ daha sonra aktif olarak makroskopik olarak izotropik birbirine bağlı bir aktin demetleri ağı halinde kendi kendini organize eder, bu da zamanla dinamik olarak kabalaşır ve sonunda büzülür. Ağ öz-organizasyonu ve büzülmesi, ağırlıklı olarak filament demetlerinin kesişme noktalarında lokalize olan miyozin agregaları tarafından yönlendirilir (Şekil 4C). Miyozin agregaları, jel kasılması yoluyla ağa bağlı kalır ve bu aktomiyosin jellerinin elastik aktif maddeler gibi davrandığı sonucuna varılabilir (Şekil 4C). Ayrıca, bu aktomiyosin jellerinde, büzülme, filament demetlerinin uçtan uca mesafeleri, l uçtan uca ve kontur uzunlukları, lcont (Şekil 4D, E) karşılaştırılarak çıkarıldığı gibi, filament kayması ile yönetilir. Bu, aktin filament burkulması29'un hakim olduğu α-aktinin tarafından çapraz bağlanmış gevşek aktin demetlerinin büzülmesiyle çelişmektedir.

Jelin gözenekliliği, çözücü akışının içinden geçtiği jel gözeneklerinin boyutu ile karakterize edilir. Saflaştırılmış aktin ağları için, jeldeki çapraz bağlar arasındaki mesafeyi tanımlayan ağ boyutu (burada, miyozin agregaları), jel gözenek boyutunun da iyi bir tahminini sağlar. Örgü boyutu doğrudan (2D) floresan görüntülerinden çıkarılabilir ve bir jel gözenekteki karşıt aktin demetlerinin çiftleri arasındaki mesafelerin geometrik ortalamasından değerlendirilir (Şekil 4B). Ağ, büzülme başlangıcına kadar izotropik olduğundan, dikey (yani kalınlık boyunca) ve yanal (yarıçap boyunca) yönlerdeki ortalama ağ boyutları aynıdır, ξ 0, = ξ 0,llEquation 23 = ξ0 (= 67 μm). Aktin demetleri kasılma sırasında düz kaldığından, ağ ve gözenek boyutları jel kalınlığı ve çapındaki değişikliklerle orantılı olarak küçülür. Mevcut deneysel sistem için, düzlem içi (radyal) büzülme, dikey büzülme pratik olarak sona erdikten sonra başlar (gösterilmemiştir), böylece radyal büzülme, başlangıç kalınlığından ~ 0.3 faktörü ile daha küçük sabit bir jel kalınlığında ilerler. Sonuç olarak, büzülme düzlemi içindeki ağ boyutu, ξ ll (t) = r (t) / R, radyal kasılma sırasında azalırken, r (t), jelin t zamanındaki yarıçapıdır, dikey yöndeki ortalama ağ boyutu sabittir, ξEquation 23 = 20μm23. Ağ/gözenek boyutlarının bu değerleri, aşağıda detaylandırıldığı gibi, jel elastik modülünü, κ'yi ve sürtünme katsayısını γ değerlendirmek için kullanılır (Amaç [iii], Şekil 6).

Amaç (ii)

Bu amaç, dışa doğru bir çözücü akışının miyozin kontraktilitesi tarafından üretildiğini göstermeyi içerir. Çözücü akışını izlemek için, aktomiyosin çözeltisine floresan boncuklar eklenir. Boncuklar, hareketli boncuklar ile aktomiyosin ağı arasındaki etkileşimi azaltmak için pasifleştirilir. Genel olarak, 1 μL boncuk (Malzeme Tablosu), oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 5 μm G-aktin ile inkübe edilir ve fazla G-aktin, santrifüjleme ile uzaklaştırılır (Malzeme Tablosu, ayrıntılar için protokol bölümüne bakın). Bu adım 10 mg·mL-1 BSA (Malzeme Tablosu) ile tekrarlanır. Boncuklar, protein çözeltisine 1:10.000 v/v'lik bir son seyreltmede eklenir. Amaç, boncukların jel gözenek boyunca serbestçe hareket etmesine izin vermek olduğundan, boncukların çaplarını jel gözenek boyutuna uyarlamak önemlidir, böylece boyut oranları her zaman <<1 olur. Bu nedenle, ortalama gözenek boyutu 15 μm'den büyük olduğunda büzülmenin başlangıç ve ara aşamalarını analiz etmek için 2.300 nm çapında boncuklar kullanılır (Şekil 5A, B) ve gözenek boyutu daha küçük olduğunda 200 nm çapında boncuklar kullanılır (Şekil 5D-G). Boncukların kütle merkezi konumu, yörüngenin (Şekil 5B) ve yerel boncuk hızının Equation 13çıkarılabileceği standart bir parçacık izleme algoritması (Malzeme Tablosu) kullanılarak her seferinde t, (x(t),y(t))boncuk için çıkarılır. Boncuklar ve dolayısıyla nüfuz eden çözücü, ortalama olarak dışa doğru radyal yönde hareket eder (Şekil 5A, B), jel ise parçacık görüntü velosimetrisi (PIV) analizinden gösterildiği gibi içe doğru büzülür (Şekil 6A'daki yeşil oklara bakınız). Bu radyal hareket, yerel boncuk hızını birlik vektörü tarafından tanımlanan radyal yöne yansıtarak değerlendirilen yerel boncukların radyal hızı νr'nin çıkarılmasıyla daha da detaylandırılabilir, jel merkezini (x 0, Equation 15y0) ve boncuk kütle merkezi konumunu t zamanında birbirine bağlar: Equation 17 neredeEquation 18

Veriler, boncukların jel merkezinden dışarıya doğru hareket ettikçe, hızlarının başlangıçta arttığını ve daha sonra jel sınırına yaklaştıkça yavaşladığını göstermektedir (Şekil 5C). Özellikle, boncuk hızı, jel radyal büzülme hızından 20 kat daha büyük olabilir ( Şekil 5C'deki mavi eğri). Doldurulmuş daireler, boncukların jelden ayrıldığı zamanı işaretler. Boncuklar bir süre jel sınırından çıktıktan sonra hareket etmeye devam eder. Bu hareket eylemsizlik etkilerinden kaynaklanamaz, çünkü Reynold sayısı <10-4'tür. Radyal boncuk hızı, jel büzülmesindeki azalma ile birlikte zamanla azalır; Özellikle, jel radyal büzülme hızı önemli ölçüde azaldığında, boncukların hızı önemli ölçüde dalgalanır.

Bu dalgalanmaların aktomiyosinin gözenekli yapısından kaynaklanıp kaynaklanmadığını test etmek için, ağ boncukların hareketini daha yüksek bir uzamsal çözünürlükte izler, bu da jelin büzülmesi önemli ölçüde yavaşladığında mümkündür (Şekil 5D-F). Boncukların yörüngesi gerçekten kıvrımlıdır (Şekil 5D, E), boncukların yerel hızında önemli dalgalanmalar vardır, bu da jelin gözenekli yapısını yansıtır - yani, yerel hız gözenek merkezine en hızlı ve bir aktin demetinin yakınında en yavaştır (Şekil 5F).

Son olarak, jel hızı-çözücü hızı korelasyon fonksiyonunun hesaplanması, lokal olarak sıvı akışının büzülme jelinin karşısına yönlendirildiğini göstermektedir. Jeldeki yerel parlak noktaları referans belirteçleri olarak kullanarak, her zaman noktası için kütle merkezi konumları, t, (x(t),y(t))jel hesaplanabilir ve yerel jel hızı türetilebilir: Equation 20. Daha sonra, her boncuk ve jeldeki yakın bir nokta için, yerel boncuk hızı-jel hız çifti korelasyonu, iki vektör arasındaki açıyı, θ'yu çıkarmak için hesaplanır: Equation 22, sırasıyla boncuk ve jelin yerel hızları (büyüklüğü) nerede Equation 23 ve Equation 24 nerededir. Veriler, boncuğun jel gözenek içindeki konumundan bağımsız olarak, lokal olarak, sıvı akışının jele göre ters yönde yönlendirildiğini göstermektedir (Şekil 5G). Genel olarak, sonuçlar, poroelastik aktif madde 3,7,23,30 için beklendiği gibi, miyozin kontraktilitesi ile dışa doğru bir sıvı akışının üretildiğini göstermektedir.

Amaç (iii)

Bu amaç, gerilme gevşemesinin, ağ elastik modülüne, gözenekliliğine ve çözücü viskozitesine bağlı olan etkili bir poroelastik difüzyon sabiti olan D ile karakterize olduğunu göstermeyi içerir. İlk olarak, büzülen jelin yanal (düzlem içi) hızı ölçülür (Şekil 6A). İlk olarak, floresan görüntüler ikilileştirilir ve her zaman noktasında jel yansıtılan alan t, A (t) çıkarılır. Daha sonra jel yarıçapı hesaplanır Equation 26 (Şekil 6B). Bundan, jel kenar hızını tanımlayan tEquation 27 zaman noktasındaki radyal büzülme hızı türetilmiştir (Şekil 6C). Kenar hızı, kenar hızının sabit bir oranda arttığı, maksimum hıza, ν max'a tmax zamanında ulaşılana kadar, Equation 28ilk doğrusal bir faz ile karakterize edilen tipik bir zamansal evrim profili gösterir. Hız daha sonra mekanik olarak kararlı bir duruma ulaşılana kadar karakteristik bir gevşeme süresi olan τ ile katlanarak azalır (Şekil 6C). Rmax, bu gevşeme aşamasının başlangıcındaki jel yarıçapıdır. 

Bir poroelastik malzeme için, gevşeme süresi Equation 33Etkili bir poroelastik difüzyon sabiti olan κEquation 34, etkili bir elastik jel modülüdür ve γ, sulu çözeltinin aktin jel gözenekleri boyunca hareketini açıklayan etkili bir sürtünme sabitidir. Elastik modül, birim hacim başına enerji birimlerine sahiptir ve jeldeki bir birim hücrenin hacmiyle ters orantılıdır, çapraz bağlar veya ağ boyutu arasındaki mesafe ile belirlenir, öyle Equation 35ki . γ sürtünme katsayısı, çözücü akışına dik gözenek fasetine bağlıdır. Düzlem içi jel büzülmesi için, ilgili gözenek faseti Equation 36, ve sonuç olarak, sürtünme katsayısı Equation 37, burada η çözücü viskozitesi31,32'dir. Genel olarak, aşağıdaki ilişkiyi elde ediyoruz: Equation 39, ilgili düzlem içi gözenek boyutunun Equation 40 tmaksimumda değerlendirildiği yer. Toplamda, gevşeme Equation 41süresinin çözücü viskozitesi23 ile doğrusal olarak ölçeklenmesi gerektiği sonucuna varıyoruz.

Bu ilişkiye uyulup uyulmadığını test etmek için, deneyler farklı miktarlarda gliserol ile tekrarlanır. Gliserol kullanımı, proteinlerin, özellikle miyozin motorlarının aktivitesini etkilemesi beklenmediğinden avantajlıdır. Ayrıca, su-gliserol çözeltilerinin viskozitesi ile eklenen gliserol miktarı arasındaki korelasyonlar literatürde mevcuttur28. Bu korelasyonlar, gliserol ağırlık yüzdesindeki% 0'dan% 34'e bir artışın, su-gliserol çözeltisi viskozitesinde η ω'dan 2.76 η ω'a orantılı bir artışa yol açtığını, burada ηω'nin20 ° C'deki su viskozitesidir. Bu gliserol aralığında ve aynı başlangıç damla çapı için, 2R = 2.800 μm, viskozitedeki bir artış, ağ polimerizasyonunun ve kendi kendine organizasyon fazlarının süresini arttırır, ancak doğrusal ivme ve maksimum radyal büzülme hızı (νmax) büyük ölçüde değişmez. Bu kanıt, hem ağ yeniden yapılanmasının (gözeneklilik) hem de miyozin aktivitesinin çözelti viskozitesi23'ten etkilenmediğini ve çözücü viskozitesinin etkisinin esas olarak elastik gerilmelerin gevşemesi için geçen süreye yansıtılması gerektiğini göstermektedir. Gerçekten de, gevşeme süresi, çözelti viskozitesine doğrusal bir bağımlılık gösterir (Şekil 6D), bu da yukarıda türetilen ölçekleme ilişkisine uyulduğu sonucuna varır ve sistemin poroelastik doğasını daha da doğrular.

Figure 1
Şekil 1: Cam kapaklı yüzey işleme prosedürünün üç ana adımının şematik açıklaması . (i) Cam yüzey temizleme (Piranha işlemi) ve hidrofilizasyon, (ii) yüzey silanizasyonu ve (iii) mPEG-mal ile pasivasyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Cam örtü kayma pasivasyonu. (A) Piranha temizleme ve silanizasyon, 12 lineer oluktan oluşan ev yapımı bir politetrafloroetilen tutucu kullanılarak 400 mL'lik bir beherde gerçekleştirilir. (B) Yüzey pasivasyonu, parafilm kaplı Petri kabında gerçekleştirilir. Her bir kapak kayması, 22 ° C'de 1 saat boyunca 1x PBS'de (Malzeme Tablosu) 4mg · mL − 1'de 1 mL 5 kDa mPEG-mal ile inkübe edilir. Hidrofobik parafilm tabakası, hidrofilik PEG polimer çözeltisinin inkübasyon süresi boyunca cam yüzeyle sınırlı kalmasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ev yapımı örnek tutucu olan bir denemeyi çalıştırma. Deneyler, standart bir mikroskop aşamasının boyutlarına uyan ev yapımı bir numune tutucuda gerçekleştirilir. (A) HG (~150 μm) kalınlığında yağlanmış bir parafilm ara parçası, PEG pasifleştirilmiş bir kapak kayması üzerine yerleştirilir ve bu kapak kayması, numune tutucusuna yerleştirilir. (B) Aktomiyosin çözeltisi bir Eppendorf tüpünde buz üzerinde hazırlanır ve bu çözeltinin 1.1 μL'si kapak kayması üzerine yerleştirilir; daha sonra (C) üzerine ikinci bir PEG pasifleştirilmiş kapak kayması yerleştirilir ve (D) numune tutucu, disk benzeri bir şekil alan damlayı sınırlamak için vidalanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Poroelastisite amacı (i). Aktomiyosin ağı elastik bir malzeme gibi davranır. (A) Bir aktomiyosin ağının şematik gösterimi. (B) Actomyosin ağ oluşumu. Floresan mikroskopi görüntüleri, aktin filamentlerinin kendiliğinden çekirdeklendiğini ve zamanla kabalaşan ve sonunda makroskopik olarak büzülen izotropik birbirine bağlı bir ağa polimerize olduğunu göstermektedir. Ağın gözenekliliği, ağ ağı boyutu, ξ (çift ok) ile karakterize edilir. (C-E) Actomyosin ağ büzülmesi, aktin filament demeti kayması ile tahrik edilir. (C) Ağ daralması jel periferinde ("P") başlar ve jel kütlesine içe doğru yayılır. Beyaz oklar kasılma yönünü gösterir. Jel merkezi bir "C" ile işaretlenmiştir. Floresan görüntüler, miyozin motor agregalarının (561 nm, kırmızı noktalar) aktin ağına (488 nm, yeşil) gömülü olduğunu ve ağ daralması boyunca ona bağlı kaldığını göstermektedir. (D) Aktin filament demetleri ağ daralması sırasında düz kalır. Kontur uzunluğunun, l devam ve uçtan uca mesafenin, luçtan uca, zamanın bir fonksiyonu olarak oranı. (E) Kontur uzunluğu ile uçtan uca mesafe arasındaki oranın t = 316 s (düz kırmızı) ve t = 327 s (çizgili, gri) olarak dağılımı. Giriş: tipik bir demetin kontur uzunluğu (mavi) ve uçtan uca mesafesi (beyaz). Koşullar: (B,C,E[inset]): Görüntüler, EMCCD kameralı ters çevrilmiş floresan mikroskopta ve 10x/0.3 Ph1 UPlanFL hava hedefinde normal modda (B) ve görüntü bindirmesinden sonra çift görüntüleme modunda (C,E[inset]) elde edilir. Ölçek çubukları (B,C) 100 μm ve (E[giriş]) 50 μm'dir. Bu rakam Ideses ve ark.23'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Poroelastisite amacı (ii). Dışa doğru bir solvent akışı, miyozin motor kontraktilitesi ile üretilir. (A) Kasılmanın ara aşamalarında jelin düşük bir büyütmede görüntülenmesi: Zamanın bir fonksiyonu olarak çözeltiye eklenen bir kasılma aktin ağının (488 nm, sol) ve 2.300 nm floresan boncukların (561 nm, sağ) eşzamanlı floresan görüntülemesi. Daireler dört boncuğun konumlarını işaretler. Oklar, boncuk hareketinin küresel yönünü işaretler. (B) Seçilen dokuz boncuğun yörüngeleri tasvir edilmiştir. Oklar, boncukların hareketinin küresel radyal yönünü işaretler. Çevrelenmiş haç, zamana karşı jel merkezini (x0,y0) (C) Yerel radyal boncuk hızı νr (açık daireler) ve (radyal) jel kenar hızını (mavi noktalar) gösterir. Doldurulmuş daireler, belirli bir boncuğun jel sınırından çıktığı zamanı gösterir. (D-F) Ağ gözenekliliğinin ve çözücünün kasılmanın ileri aşamalarında jel gözenekleri boyunca hareketinin çözülmesi. (D) Çözeltiye eklenen büzülme jelinin epifloresan görüntüleri ve 200 nm çapında floresan boncuklar. Hem aktin hem de boncuklar 488 nm'de uyarılır. Kırmızı daireler zamanla bir boncuğun konumunu takip eder. Gri çizgi jel sınırını gösterir. (E) (D)'de gösterilen boncuğun yörüngesi. Gösterilen alanda, jel ortalama olarak aşağıya doğru büzülür. Koordinatlar kameranın kökenine göre ölçülür. (F) Boncuğun yerel hızı, jelin gözenekli yapısını yansıtır. Üst: Zamana karşı yerel boncuk hızı (açık daireler), yerel jel hızı (gri daireler) ve jel kenar hızı (mavi daireler). Alt: Anlık görüntüler, boncuğun seçilen zamanlardaki konumunu gösterir. Boncuk kırmızı bir daire ile işaretlenmiştir. Kesikli çizgi, boncuğun jelden çıktığı zamanı gösterir. (G) Yerel jel ve yerel boncuk hızları arasındaki açıların dağılımı. Koşullar: Görüntüler, EMCCD kameralı ters çevrilmiş floresan mikroskopta ve (A) 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR objektif ve (D,F) 10x/0.3 Ph1 UPlanFL objektif ile elde edilir. Ölçek çubukları (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) ve 50 μm'dir. Bu rakam Ideses ve ark.23'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Poroelastisite amacı (iii). stres gevşemesi, etkili bir poroelastik difüzyon sabiti ile karakterizedir. (A) Karıştırma süresinden kararlı duruma kadar düşük büyütmede büzülen bir aktomiyosin jelinin üstten görünümlü floresan görüntüleri. Hız alanı (yeşil oklar) PIV analizinden çıkarılır. Görüntüler, EMCCD kamera ve 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR hedefi ile ters çevrilmiş floresan mikroskopta elde edilir. Uyarma dalga boyu 488 nm'dir (aktin). Ölçek çubuğu 500 μm'dir. (B) Jel yarıçapı ve (C) radyal büzülme hızı, (yani, zamana karşı jel kenar hızı). A hızlanmayı, Equation 53 Vmax maksimum hızı ve τ karakteristik bir rahatlama zamanını gösterir. (D) Aktomiyosin ağları poroelastik aktif bir madde gibi davranır. Equation 55 ve çözücü viskozitesi, η, gliserol ağırlık yüzdesine (ağırlıkça% karşılığında). Miktarlar ağırlıkça% 0 gliserol değerlerine normalleştirilir. Jelin başlangıç yarıçapı R = 1.400 μm'dir. Hata çubukları, deneysel değerlerin standart sapmalarıdır. Bu rakam Ideses ve ark.23'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin mekaniğini, hücre sitoiskeletinin ve daha genel olarak, poroelastik bir materyal olarak davrandığı gösterilen hücre sitoplazmasının model bir sistemi olarak karakterize etmek için in vitro bir yaklaşım kullanılmaktadır 3,5. Hücre sitoiskeletinin (sitoplazma) reolojisi, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içi sitozolik sıvının hücre içinde yeniden dağılmasının ne kadar süreceğini belirleyen bir poroelastik difüzyon sabiti ile karakterize edilmiştir. Hücrelerin şekillerini düzenlemek için bu mekanizmayı kullanmaları önerilmiştir5.

Bu bulgulardan motive olarak, in vitro poroelastisiteyi incelemek için bir çerçeve geliştirdik. Önerilen model sistemini kullanarak, miyozin kontraktilitesinin bir sıvı akışının ortaya çıkmasına nasıl katkıda bulunduğuna ve ağ hızının ve çözücü hızının, yönlülüğün ve hızın zaman ve uzayda nasıl ilişkili olduğuna dair içgörüler sunuyoruz. Bu sayede, ağın ve gömülü çözücünün birbirine bağlı olduğunu ve ayrı nesneler olarak kabul edilemeyeceğini gösteriyoruz. Deney düzeneğini açıklıyoruz ve jelleri hazırlamak ve bir deney yapmak için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Veri nicelleştirme için ayrıntılı bir çerçeve de sunulmaktadır. Önerilen çerçeve, araştırılan deneysel sistemin özgüllüğünden bağımsız olarak, çeşitli deneysel kurulum ve sistemlerde poroelastisiteyi incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Aktomiyosin ağlarının poroelastisitesini, stres gevşemesinin zaman ölçeğindeki değişiklikleri analiz ederek doğruluyoruz. Bunu, aktomiyosin çözeltisine çeşitli miktarlarda gliserol ekleyerek ortamın viskozitesini değiştirerek göstermeyi seçiyoruz. Gliserol kullanmanın avantajı, ağların gözenekliliğini ve yapısını etkilememesidir ve bu nedenle, stres gevşemesi üzerindeki tek etki, hareketli çözelti ile jel gözenekleri arasındaki sürtünmenin artmasıdır23. Ağ gözenekliliğindeki değişiklikler ek bir komplikasyona neden olurdu, çünkü hem elastik modül hem de ağ gözenek boyutu gevşeme süresini doğrusal olmayan bir şekilde etkiler 23,31,32.

Başarılı deneyler yapmak, cam kapakların inert bir polimerle pasivasyonunu gerektirir. Bu adım çok önemlidir. Burada cam pasivasyonu için kullanılan prosedür, pasivasyonun kalitesi korunursa diğer prosedürlerle değiştirilebilir33,34. Kusurlu yüzey pasivasyonu, ağ montajını engelleyebilen masif protein yapışmasına neden olabilir. Cam pasivasyonu, sözleşme jelinin cam yüzeylerle etkileşimini önlemek için de önemlidir. Bu, burada ele alınan sıvı-jel sürtünmesine ek olarak, tahmin edilmesi veya ölçülmesi çok daha zor olacak ek bir sürtünme terimine yol açacaktır. Yüzey pasivasyonunun yanı sıra, başarılı deneyler taze aktin kullanımını gerektirir. Ayrıca, motorların aktivitesi de çok önemlidir ve taze miyozin partilerinin hazırlanması her 3-4 ayda bir tekrarlanmalıdır.

Genel olarak, bu deneysel yaklaşımın in vitro poroelastisiteyi incelemek için başarılı olduğu gösterilmiştir. Şu anda kullanılan deneysel prosedürün bir sınırlaması, ilk jel boyutlarının daha sağlam bir şekilde nasıl kontrol edileceğidir. Bir seçenek, kontrol edilebilir boyutlarda önceden oluşturulmuş odalar kullanmak olacaktır. Önceden oluşturulmuş odaların kullanılması, yalnızca araştırmacının sistem boyutunu daha iyi kontrol etmesini değil, aynı zamanda sistemin geometrisini kolayca değiştirmesini de sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Dina Aranovich'e protein saflaştırma ve etiketleme için teşekkür ederiz. G.L., Jabotinsky Doktora Bursu için İsrail Bilim, Teknoloji ve Uzay Bakanlığı'na minnettardır. A.B.G., İsrail Bilim Vakfı'na (hibe 2101/20) ve İsrail Devleti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'na (hibe 3-17491) mali destek için minnettardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich Company 175617 Stored under Argon atmosphere at 4 °C 
Acetic acid Bio-Lab ltd 1070521
Alexa-Fluor 488 Invitrogene A10254 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
Alexa-Fluor 647 Invitrogene A20347 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
BSA Sigma -Aldrich Company A3059 Stored at 4 °C 
Catalase Sigma -Aldrich Company C9322 The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips Mezel-glaser CG2222-1.5 Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase Roche Life Science Products 10736988001 Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate Roche Life Science Products 10621714001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT Roche Life Science Products 10708984001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System  Photometrics DV2-CUBE
EGTA MP Biomedicals 195174
EM-CCD Camera Andor Technology Ltd DV 887
EM-CCD Camera Photometrics Evolve Delta
Ethanol Bio-Lab ltd 525050300
Flourescence Lamp Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres Polysciences 17151-10 200 nm diameter
Glucose ICN Biomedicals Inc 194024 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase Sigma-Aldrich Company G7141 Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol ICN Biomedicals Inc 800687
Glycine MP Biomedicals 808822
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich Company 216763 Stored at 4 °C 
KCl EMD Millipore Corp. 529552
Methanol Bio-Lab ltd 1368052100
MgCl2 EMD Millipore Corp. 442615
Microscope Leica Microsystems DMI3000
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-5k  Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres Spherotech FP-2056-2  2300 nm diameter
Objective (10x) Leica Germany HC PL AP0 UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x) Leica Germany 506304  Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven WTC Binder
Parafilm Amcor PM-996
PBS Buffer Sigma-Aldrich Company P4417
Shutter Driver Vincet Associates VMM D1
Silica gel Merck 1.01907.5000
Sonicator Elma Elmasonic P
Sulfuric acid Carlo Erba reagents 410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System Photometrics
TRIS MP Biomedicals 819620
UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E Gilson FD10001 1–10 uL
MATLAB R2017b MathWorks Data quantification 
MetaMorph  Molecular devices Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Tags

Biyomühendislik Sayı 193 Aktin miyosin aktif kontraktil ağlar aktomiyosin poroelastisite sıvı akışı sitoiskelet-sitosol hız-hız korelasyonu
Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S.,… More

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S., Bernheim-Groswasser, A. The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (193), e64377, doi:10.3791/64377 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter