Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mekaniken i (poro-)elastiska kontraktila aktomyosinnätverk som modellsystem för cellcytoskelettet

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64377
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

Summary

I detta arbete används en in vitro-rekonstitueringsmetod för att studera poroelasticiteten hos aktomyosingeler under kontrollerade förhållanden. Dynamiken hos aktomyosingelen och det inbäddade lösningsmedlet kvantifieras, genom vilket nätverksporoelasticiteten demonstreras. Vi diskuterar också experimentella utmaningar, vanliga fallgropar och relevans för cellcytoskelettmekanik.

Abstract

Celler kan aktivt ändra sina former och bli rörliga, en egenskap som beror på deras förmåga att aktivt omorganisera sin interna struktur. Denna funktion tillskrivs de mekaniska och dynamiska egenskaperna hos cellcytoskeletten, särskilt aktomyosincytoskelettet, som är en aktiv gel av polära aktinfilament, myosinmotorer och tillbehörsproteiner som uppvisar inneboende kontraktionsegenskaper. Den vanligtvis accepterade uppfattningen är att cytoskeletten beter sig som ett viskoelastiskt material. Denna modell kan emellertid inte alltid förklara de experimentella resultaten, som är mer förenliga med en bild som beskriver cytoskelettet som ett poroelastiskt aktivt material - ett elastiskt nätverk inbäddat med cytosol. Kontraktilitetsgradienter genererade av myosinmotorerna driver cytosolens flöde över gelporerna, vilket innebär att cytoskelettens och cytosolens mekanik är tätt kopplade. En huvudegenskap hos poroelasticitet är diffusiv avslappning av spänningar i nätverket, kännetecknad av en effektiv diffusionskonstant som beror på gelens elastiska modul, porositet och cytosol (lösningsmedel) viskositet. Eftersom celler har många sätt att reglera sin struktur och materialegenskaper, är vår nuvarande förståelse för hur cytoskelettmekanik och cytosolflödesdynamik är kopplade fortfarande dåligt förstådd. Här används en in vitro-rekonstitueringsmetod för att karakterisera materialegenskaperna hos poroelastiska aktomyosingeler som ett modellsystem för cellcytoskelettet. Gelkontraktion drivs av myosinmotorkontraktilitet, vilket leder till uppkomsten av ett flöde av det penetrerande lösningsmedlet. Papperet beskriver hur man förbereder dessa geler och kör experiment. Vi diskuterar också hur man mäter och analyserar lösningsmedelsflödet och gelkontraktionen både på lokal och global skala. De olika skalningsrelationerna som används för datakvantifiering ges. Slutligen diskuteras experimentella utmaningar och vanliga fallgropar, inklusive deras relevans för cellcytoskelettmekanik.

Introduction

Levande celler har unika mekaniska egenskaper. Förutom förmågan att passivt reagera på applicerade krafter kan de också aktivt generera krafter som svar på yttre stimuli1. Dessa egenskaper, som är väsentliga för en mängd olika cellulära processer, särskilt under cellmotilitet, tillskrivs främst de mekaniska och dynamiska egenskaperna hos cellcytoskelettet, särskilt aktomyosincytoskelettet, som är en aktiv gel av polära aktinfilament, myosinmolekylära motorer och tillbehörsproteiner. Dessa aktomyosinnätverk uppvisar inneboende självorganisation och kontraktionsegenskaper som drivs av myosinmotorproteinerna, som tvärbinder aktinfilamenten och aktivt genererar mekaniska spänningar i nätverket som drivs av ATP-hydrolys2.

Många experimentella och teoretiska studier har genomförts för att studera materialegenskaperna hos cytoskelett3. Den allmänt accepterade uppfattningen är att cytoskeletten beter sig som ett viskoelastiskt material4. Detta innebär att cytoskeletten på korta tidsskalor beter sig som ett elastiskt material, och på långa tidsskalor beter sig det som en viskös vätska på grund av tvärbindningsproteinerna och myosinmotoravskiljningen (och återfästning), vilket gör att nätverket dynamiskt kan omsättas. I många situationer kan dock den viskoelastiska modellen inte beskriva de experimentella resultaten, som är mer förenliga med en bild som beskriver cytoskelettet och, mer allmänt, att cellcytoplasman beskrivs som ett poroelastiskt aktivt material 5,6. Två huvudfunktioner karakteriserar dessa typer av material. (i) Den första huvudfunktionen är genereringen av ett flöde av den penetrerande cytosolen ("lösningsmedlet") över gelporerna genom kontraktilitetsgradienter som drivs av myosinmotorerna, som ligger till grund för processer som cellblåsning7, rörlighet8 och cellformsvängningar9. Framväxten av sådana cytosoliska flöden kan vara lokal, för blebbing eller global, som i cellmotilitet. I det senare fallet driver de kontraktila applicerade spänningarna vid cellens baksida flödet av cytosolvätskan mot cellfronten, vilket fyller på proteinpoolen som behövs för lamellipodia-montering8. (ii) Den andra huvudegenskapen är att avslappningen av spänningar är diffusiv och kännetecknas av en effektiv diffusionskonstant, som beror på gelens elastiska modul, gelporositet och lösningsmedelsviskositet5. Den poroelastiska diffusionskonstanten bestämmer hur snabbt systemet reagerar på en pålagd spänning. Högre diffusionskonstanter motsvarar snabbare spänningsfördelning. Detta bestämmer i sin tur hur lång tid det tar för den intracellulära cytosolvätskan att omfördelas i cellen efter applicerad mekanisk stress, vare sig den är extern eller intern, såsom de aktiva kontraktila spänningarna som genereras av myosinmotorer. Dessa exempel visar således att cytoskelettens och cytosolens mekanik är tätt kopplade och inte kan behandlas separat3.

Eftersom celler kan reglera sina mekaniska egenskaper på olika sätt är samspelet mellan nätverksmekanik och vätskeflödesdynamik fortfarande dåligt förstått. Ett kraftfullt alternativt tillvägagångssätt är att använda in vitro rekonstituerade system som möjliggör full kontroll över de olika mikroskopiska beståndsdelarna och systemparametrarna, vilket gör dessa modellsystem optimala för fysisk analys10,11. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att studera effekterna av proteinsammansättning och systemgeometri på aktinbaserad motilitet 12,13,14,15,16,17,18, 2D-mönstring av aktomyosinnätverk 19,20,21,22, och samspelet mellan nätverkskontraktilitet och vätskeflödesdynamik hos poroelastiska aktomyosingeler, vilket är fokus för denna uppsats23.

I detta manuskript diskuteras beredningen av kontraktila elastiska aktomyosinnätverk av kontrollerbara dimensioner och materialegenskaper baserat på Ideses et al.23. Dynamiken hos den kontraherande gelén och det dränerade lösningsmedlet analyseras och kvantifieras, genom vilket det visas att dessa aktomyosingeler kan beskrivas som ett poroelastiskt aktivt material. Att studera effekten av lösningsmedelsviskositet på spänningsdiffusivitet bekräftar ytterligare den poroelastiska karaktären hos dessa nätverk. De olika skalningsrelationer som används för datakvantifiering tillhandahålls. Slutligen diskuteras även de experimentella utmaningarna, de vanliga fallgroparna och de experimentella resultatens relevans för cellcytoskelettet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ytbehandling och passivering av glas:

OBS: Detta avsnitt innehåller tre huvudsteg (se figur 1): (i) rengöring och hydrofilisering, (ii) silanisering och (iii) ytpassivering.

  1. Rengöring och hydrofilisering
    1. Använd Piranha lösning för rengöring av glasytor.
      Piranha-lösningen är en blandning av 30% H2O2 och 70%H2SO4(Materialtabell). Dess främsta mål är att avlägsna organiska föroreningar från täckglasytor och exponera OH-grupperna på glasytan. På detta sätt blir glasytan hydrofil.
    2. Placera 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) glastäckglas (Materialförteckning) i en hemmagjord polytetrafluoretylenhållare (basyta: 5,5 cm x 5,5 cm). Överför polytetrafluoretylenhållaren till en 400 ml bägare (materialtabell) och inkubera den med 300 ml Piranha-lösning i 2 timmar. Gör detta steg på is och i en kemisk huva.
      OBS: Polytetrafluoretylenstången som skruvas fast på hållarens bas är 12 cm lång, längre än bägaren (11 cm), vilket möjliggör säker överföring/utdragning av hållaren till/från Piranha-lösningen. Eftersom Piranha-lösningen fortfarande kan vara mycket reaktiv och mycket varm är det absolut nödvändigt att stoppa reaktionen. Det enklaste sättet att stoppa reaktionen är att hälla Piranha-lösningen i (kran) vatten för att uppnå en 50x utspädning (minst). Lösningen kan sedan kasseras på ett säkert sätt. Förvara aldrig den använda Piranha-lösningen i en sluten glasflaska - det kan sluta i en flaskexplosion.
    3. Överför polytetrafluoretylenhållaren till en ren bägare fylld med färskt dubbeldestillerat vatten (DDW) för att tvätta överflödig Piranha från täckglasen.
    4. Överför bägaren till ett ultraljudsbehandlingsbad (Materialtabell) och ultraljudsbehandling vid 80 Hz vid full effekt i 10 minuter vid 25 °C. Upprepa detta steg ytterligare två gånger med färsk DDW. Använd färsk DDW vid varje tidpunkt.
  2. Silanisering
    1. Överför hållaren till en ren bägare (400 ml) fylld med 300 ml ren metanol (Table of Materials) och sedan till ett ultraljudsbehandlingsbad (Table of Materials). Sonicate vid 80 Hz vid full effekt i 30 min vid 25 ° C.
    2. Efter ultraljudsbehandling, överför hållaren till en silanlösning framställd med användning av 15 ml DDW, 3,1 ml ättiksyra (materialtabell), 340 ml metanol och 7,6 ml silan ((3-merkaptopropyl) trimetoxisilan) (materialförteckning). Förslut bägaren med parafilm och förvara den i kylen vid 4 °C över natten.
      OBS: Beredningen och hanteringen av silanlösningen måste utföras i en kemisk huv. Efter silaniseringssteget, lägg den använda silanlösningen (avfall) i en dedikerad glasflaska i den kemiska huven.
    3. Nästa dag, överför hållaren till en ren bägare fylld med 300 ml ren metanol i 15 sekunder. Överför sedan hållaren till en ren bägare, inte innan du torkar botten på polytetrafluoretylenhållaren för att avlägsna överskott av metanol. Överför bägaren till ugnen (Table of Materials) för att torka glastäcket i 5 min vid 120 °C.
  3. Ytpassivering med en inert polymer
    1. Uppnå ytpassivering genom att inkubera glastäckglasen med en inert polymer (Table of Materials). För varje experiment, ta två täckglas och placera dem i en petriskål belagd med ett parafilmskikt som ursprungligen rengjorts med etanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (Materialförteckning).
    2. Inkubera varje täckglas med 1 ml 4 mg·ml−1 5 kDa molekylvikt metoxipolyetylenglykolmaleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Materialförteckning) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (Materialförteckning) i 1 timme vid 22 °C.
      OBS: Placering av täckglasen på ett hydrofobt parafilmskikt begränsar den hydrofila PEG-polymerlösningen till glastäckets yta. Inkubationstiden är avgörande för att uppnå optimal passivering. Använd inkubationstider mellan 45 min och 2 timmar. Över denna inkubationstid kan glastäckets yta försämras, vilket leder till proteinvidhäftning och förlust av transparens.
    3. Vid slutet av inkubationsprocessen, skölj varje täckglas med 5 ml DDW och torka med ett flöde avN2 (gas). Torka inte täckglasen under vakuum. Eftersom täckglasen måste hållas våta efter passivering, lägg omedelbart 1 ml 10 mM Tris på de pegylerade ytorna. Använd täckglasen inom 2 timmar.
      OBS: De olika stegen måste utföras i en laminär flödeskammare för att förhindra kontaminering av glasytan.

2. Proteinrening

  1. Rena G-aktin från kanin, skelettmuskelacetonpulver med gelfiltreringsmetod24.
    1. Actin-rening tar 1 vecka. Förvara det renade G-aktinet i G-buffert (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP och 1 mM DTT) och förvara det på is. Använd lösningen inom 2 veckor.
      OBS: Byt ut isen varannan dag.
    2. Märk aktinet med ett maleimidmodifierat fluorescerande färgämne16 (Materialtabell). Rena GST-fascin baserat på metoden från Ono et al.25. Snabbfrys båda proteinerna i vätskaN2 och förvara vid −80 °C.
  2. Använd ett standardprotokoll för att rena myosin II från kaninskelettmuskulatur26. Den renade myosin II (dimerer) lagerbufferten inkluderar 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl och 35% w/v sackaros. Frys myosinet i vätskaN2 och förvara vid -80 °C.
    OBS: Den höga koncentrationen av KCl håller myosinmotorerna i en dimer form, medan den höga andelen sackaros säkerställer att motorernas aktivitet inte hindras vid frysning. Använd en särskild pipett för viskös vätskehantering när du arbetar med myosin II-stamlösningar (Table of Materials).
    1. Märk myosin II-dimererna med ett fluorescerande färgämne (materialtabell) vid par konstruerade cysteinrester19,27. Använd en kycklingmage RLC-mutant A för detta ändamål26. Frys den märkta myosin II i vätskaN2 och förvara vid -80 ° C.
      OBS: Denna märkningsprocedur säkerställer att den märkta myosinen är aktiv som det ursprungliga myosin II-proteinet.
  3. Använd en UV-Vis-spektrofotometer (Table of Materials) för att mäta absorptionen av stamproteinlösningarna och härleda proteinkoncentrationerna med Beer-Lambert-lagen med hjälp av följande extinktionskoefficienter: G-aktin (ε290 = 26 460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1·cm−1), myosin II-dimer (ε280 = 268 800 M−1·cm−1), och RLC-mutant A (ε280 = 3 960 M−1·cm−1)19.

3. Beredning av prov

OBS: Polymerisera aktinmonomererna i närvaro av stora aggregat av myosin II-motorer och den starka passiva tvärbindaren fascin för att producera makroskopiskt kontraktila elastiska aktomyosinnätverk19,23. Tillsats av fluorescerande pärlor till lösningen gör det möjligt att spåra lösningsmedelsflödet under gelkontraktion.

  1. Protein ("actomyosin") lösning
    1. Med undantag för G-aktin, förvara proteinerna vid −80 °C i små alikvoter och tina dem vid 37 °C före användning. Actomyosinlösningens totala volym är 40 μl.
    2. Bered lösningen genom att blanda 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ett ATP-regenererande system (0,5 mg · ml −1 kreatinkinas och 5 mM kreatinfosfat), 200 μM EGTA (kelater Ca2+ joner), en blekningslösning (0,1 mg · ml −1 glukosoxidas, 0,018 mg · ml − 1 katalas och 5 mg · ml − 1 glukos), 5 μM G-aktin, 280 nM GST-fascin och 1,67 nM myosin II. Andelen märkt G-aktin är 5% (molär procentandel).
      OBS: Använd en låg andel märkt G-aktin för att undvika mättnad av den fluorescerande signalen vid de avancerade stadierna av gelkontraktion.
  2. Förbereda myosin II-motoraggregat
    1. Tillsätt myosinmotorerna till proteinlösningen i form av aggregat. För att bilda stora myosinaggregat (150 myosindimerer/aggregat), späd myosinstamlösningen med 10 mM Tris pH 7,4 för att nå en slutlig koncentration på 25 mM KCl.
    2. Håll den utspädda myosinlösningen i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) och överför den sedan till is tills den används. Motorerna är fullt aktiva i upp till 2 timmar.
  3. Mätning av lösningsmedelsflödet
    1. För att spåra lösningsmedelsflödet över gelporerna, tillsätt de fluorescerande pärlorna till aktomyosinlösningen. Minska interaktionen mellan pärlorna och actomyosin-nätverket genom att passivera pärlorna. Inkubera praktiskt taget 1 μL pärlor (materialtabell) med 5 μM G-aktin i 20 minuter vid rumstemperatur och avlägsna sedan överskott av G-aktin genom centrifugering (materialtabell) (förhållanden: 6 000 x g i 5 minuter vid 4 °C).
    2. Upprepa detta steg med 10 mg·ml−1 bovint serumalbumin (BSA) (Materialförteckning) för att blockera (eventuellt) den återstående obelagda ytan. Använd pärlorna i en slutlig utspädning på 1:10 000 vol/vol i experimenten.
      OBS: Det är viktigt att anpassa pärlornas diameter till gelporstorleken så att förhållandet mellan pärla och porstorlek är <1 i alla steg.
  4. Effekt av lösningens viskositet
    1. Kontrollera lösningens viskositet genom tillsats av glycerol (materialförteckning) till aktomyosinlösningen. Tillsats av glycerol med en viktprocent som sträcker sig från 0% till 34% inducerar en motsvarande ökning av lösningens viskositet från η ω till 2,76 η ω, där η ω är viskositeten hos vatten vid 20 °C28.
      OBS: Det är viktigt att använda en särskild pipett för viskös vätskehantering när du arbetar med glycerol (Table of Materials).

4. Köra ett experiment

  1. Hemmagjord hantering av provhållare
    1. Ta ett av de PEG-passiverade täckglasen, placera en smord parafilmdistans ovanpå den och placera den i provhållaren.
      OBS: Man kan ersätta parafilm spacer med någon spacer.
  2. Förbereda actomyosin-lösningen
    1. Förbered aktomyosinlösningen på is i ett mikrocentrifugrör genom att införliva de olika mikroskopiska beståndsdelarna, tillsätta myosin II-motoraggregaten och tillsätta EGTA sist. Blanda lösningen väl. Tillsatsen av EGTA initierar actomyosin-nätverkspolymerisation, vilket ställer in experimentets starttid.
  3. Lägg 1,1 μL av lösningen på det hållarmonterade täckglaset och placera det andra täckglaset ovanpå. Skruva fast hållaren för att försegla provet. Denna process pressar något droppen, som antar en skivliknande form. Falldiametrarna varierar mellan 2 800 och 3 000 μm.
  4. Placera provhållaren på mikroskopet och starta förvärvet. Förbered mikroskopet i förväg för att minska den ursprungliga förvärvstiden. Det tar vanligtvis 1-2 minuter efter blandning för att starta provavbildningen.

5. Mikroskopitekniker

  1. Avbilda proverna med hjälp av ett inverterat fluorescerande mikroskop (Table of Materials) som styrs av dedikerad programvara (Table of Materials).
    1. Använd låga förstoringar på 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-målet (Table of Materials) för att visualisera hela gelområdet och följa dess makroskopiska sammandragning med tiden.
    2. Använd ett 10x/0.3 Ph1 UPlanFL-mål (Table of Materials) för att karakterisera nätverkets porositet och struktur och för att följa nätverkets självorganisation och sammandragning med tiden.
      OBS: Detta mål är också användbart för att lokalisera myosin II-motoraggregaten inom nätverket och följa rörelsen av fluorescerande pärlor över gelporerna. Högre förstoringar kan användas på bekostnad av ett reducerat synfält, vilket är ännu viktigare i dubbelfärgsbildläge (materialförteckning).
  2. Hetsa proverna vid 488 nm (aktin/fluorescerande pärlor) och 561 nm (myosinmotoraggregat/fluorescerande pärlor). Hämta bilderna med 100 ms per bildruta med dedikerad programvara (Table of Materials) i strömningsläge med en EMCCD-kamera (electron multiplication charge-coupled device) (Table of Materials).
    OBS: Lysrörets (materialtabell) intensitet bör hållas på lägsta möjliga värde för att undvika signalmättnad under nätverkskontraktion.
  3. Samtidig tvåfärgsavbildning
    1. Använd detta läge för två ändamål: (i) detektering av lokaliseringen av myosinmotoraggregaten inom aktinnätverket och (i) karaktinflöde inuti och utanför under nätverkskontraktion.
    2. Excitera aktin- och myosin II-motorerna vid 488 nm respektive 561 nm och spela in bilderna samtidigt på en EMCCD-kamera (Table of Materials) med hjälp av en dubbelemissionsapparat (Table of Materials). Använd samma bildsystem för att samtidigt avbilda aktinggelen (488 nm) och lysrörspärlorna (561 nm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två glastäckglas används per experiment. Glastäckglasen rengörs och passiveras med PEG-polymerer. Passivering är avgörande för att förhindra att de solubiliserade proteinerna fäster vid glasytorna i de tidiga experimentella stadierna och för att minimera interaktionen mellan det kontrakterande nätverket och glasväggarna. Underlåtenhet att uppnå god passivering kan leda till ineffektiv sammandragning och kan i extrema fall till och med hämma bildandet av aktinnätverk.

I figur 1 beskrivs de tre huvudstegen i ytbehandlingsproceduren. Dessa steg inkluderar följande: (i) ytrengöring och hydrofilisering med hjälp av en Piranha-lösning, som avlägsnar organisk förorening från täckglasytorna och exponerar OH-grupperna på glasytan; ii) ytsilanisering med (3-merkaptopropyl)trimetoxisilan, som syftar till att kovalent binda silanen till glasytan, där varje silanmolekyl slutar med en SH-grupp; iii) passivering med PEG-polymerer (mPEG-mal, 5 kDa) – i detta steg interagerar maleimidgruppen i PEG-polymeren kovalent med SH-gruppen på (3-merkaptopropyl)trimetoxisilan, vilket resulterar i bildandet av ett PEG-monolager på glasytan.

För Piranha-behandling och silanisering placeras 10-12 glastäckglas # 1,5 (22 mm x 22 mm) i en polytetrafluoretylenhållare (figur 2A), och den hållaren överförs till en 400 ml bägare. För passiveringssteget överförs två glastäckglas till en parafilmbelagd petriskål (figur 2B). Placering av täckglasen på ett hydrofobt parafilmskikt säkerställer att den hydrofila PEG-polymerlösningen förblir begränsad till glasytan under hela inkubationstiden. Varje täckglas inkuberas med 1 ml 4 mg·ml−1 5 kDa mPEG-mal i 1x PBS i 1 timme vid 22 °C (figur 2B). För denna PEG-polymer molekylvikt och koncentration leder glaspassivering till bildandet av ett PEG-monolager, där varje PEG-polymer befinner sig i en svampliknande konformation29. Vid slutet av inkubationsprocessen sköljs varje täckglas med 5 ml DDW och torkas med ett flöde avN2 (gas). Om täckglasen inte används omedelbart bör 1 ml 10 mM Tris läggas på de pegylerade ytorna för att hålla täckglasytorna våta. Täckglasen torkas med ett flöde avN2 (gas) strax innan ett experiment påbörjas. Det är bättre att använda täckglasen inom 2 timmar.

Makroskopiskt kontraktila elastiska aktomyosinnätverk bildas genom att blanda 5 μM G-aktin med 16,7 nM myosin, som tillsätts i form av stora aggregat (~ 150 myosindimerer/aggregat) och 280 nM av den starka tvärbindarfascin. Lösningen innefattar 1 mM ATP, som hålls konstant med hjälp av ett ATP-regenererande system och en antiblekningslösning (se detaljer i protokollavsnittet). För att analysera flödet av det penetrerande lösningsmedlet tillsätts fluorescerande pärlor till aktomyosinlösningen.

Experimenten körs i en hemlagad provhållare, som passar dimensionerna för ett standardmikroskopsteg (figur 3). Ett smurt parafilmdistans med tjockleken h (~150 μm) placeras på ett av två PEG-passiverade täckglas, och detta täckglas placeras i provhållaren (figur 3A). Därefter framställs aktomyosinlösningen på is i ett mikrocentrifugrör genom att införliva de olika mikroskopiska beståndsdelarna, tillsätta sist G-aktin, myosinaggregat och sedan EGTA, vilket utlöser aktinpolymerisation. Lösningen måste blandas väl - detta ställer in experimentens starttid (t = 0). Omedelbart placeras 1,1 μl av denna lösning på täckglaset (figur 3B), det andra PEG-passiverade täckglaset placeras ovanpå det (figur 3C) och hållaren skruvas fast för att begränsa droppen mellan dem (figur 3D). För denna fallvolym och distanstyp är falldiametern cirka 3 000 μm, men forskare bör inte förlita sig på dessa uppskattade värden. Den faktiska falltjockleken och diametern bör alltid mätas direkt från mikroskopibilderna. För tjockleken bör ett konfokalmikroskop användas.

Provhållaren placeras på mikroskopet och förvärvet startas. Mikroskopet bör förberedas i förväg för att minska tiden för att starta förvärvet till ett minimum. Det tar vanligtvis 1-2 minuter att starta provavbildningen. Proverna exciteras vid 488 nm och / eller 561 nm och avbildas med hjälp av ett inverterat fluorescerande mikroskop som styrs av en dedikerad programvara. Bilderna bör tas med en hastighet av 100 ms per bildruta (eller mindre) i strömningsläge med en EMCCD-kamera. För att samtidigt avbilda aktinnätverket och myosinmotoraggregaten, eller de fluorescerande pärlorna i lösningen, bör ett dubbelemissionssystem användas. Lysrörets intensitet bör hållas så låg som möjligt för att undvika signalmättnad i de avancerade stadierna av nätkontraktion.

Ett 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-mål används för att karakterisera gelens laterala kontraktionsdynamik och vätskeflödets riktning och hastighet på gelens längdskala. Dessa är bilder med låg upplösning som är användbara för att följa förändringarna i gelradie med tiden, från vilken gelens radiella (laterala) kontraktionshastighet kan härledas. För att lösa nätverkets struktur och porositet, placeringen av myosinmotoraggregaten inom nätverket och rörelsen av enskilda fluorescerande pärlor över gelporerna, bör högre förstoringsmål användas (t.ex. ett 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL-mål). Högre förstoringar kan också användas men på bekostnad av ett minskat synfält, vilket är mer betydelsefullt om dubbelfärgsavbildningsläget används. Data från (2D) fluorescensmikroskopi bör kompletteras med konfokal avbildning av den kontrakterande gelen i 3D för att karakterisera kontraktionsdynamiken i både lateral och vertikal riktning. Konfokalmikroskopi används för att mäta avståndet mellan de två täckglasen - detta avstånd definierar den initiala geltjockleken. Dessutom bör gelens tjocklek mätas i slutet av experimentet när ett mekaniskt stabilt tillstånd uppnås.

Flera kriterier måste uppfyllas för att visa att aktomyosinnätverken beter sig som ett poroelastiskt material: (i) nätverket omformas inte, vilket skulle leda till att det beter sig som ett elastiskt material (figur 4), (ii) vattenflödet (lösningsmedel) över gelporerna drivs av myosinkontraktilitet (figur 5), och (iii) den elastiska spänningsavslappningen kännetecknas av en effektiv diffusionskonstant, D ~ κ / γ, som beror på gelens effektiva elastiska modul, κ, och den effektiva friktionskonstanten, γ, som står för friktionen mellan det rörliga lösningsmedlet och gelporerna (figur 6). Nedan diskuterar vi varje kriterium separat och visar hur de uppfylls i det nuvarande systemet.

Syfte i)

För det första bör gelstrukturen och porositeten analyseras, och det bör bestämmas om nätverket är dynamiskt ombyggnad. En schematisk representation av aktomyosinnätverket visas i figur 4A. Nätverksbildning börjar med spontan kärnbildning och polymerisation av aktinfilamenten, som därefter buntas (figur 4B). Nätverket självorganiserar sedan aktivt i ett makroskopiskt isotropt sammankopplat nätverk av aktinbuntar, som dynamiskt fördjupas med tiden och så småningom drar ihop sig. Nätverkets självorganisation och sammandragning drivs av myosinaggregaten, som övervägande lokaliseras vid skärningspunkterna för filamentbuntarna (figur 4C). Myosinaggregaten förblir fästa vid nätverket genom gelkontraktion, från vilken man kan dra slutsatsen att dessa aktomyosingeler beter sig som elastiska aktiva material (figur 4C). Vidare styrs kontraktionen i dessa aktomyosingeler av filamentglidning, vilket härleds genom att jämföra filamentbuntarnas end-to-end-avstånd, l end-to-end och konturlängder, lcont (figur 4D, E). Detta står i kontrast till sammandragningen av lösa aktinbuntar tvärbundna av α-aktinin, som domineras av aktinfilamentknäckning29.

Gelens porositet kännetecknas av storleken på gelporerna genom vilka lösningsmedelsflödet rör sig. För renade aktinnätverk ger maskstorleken, som definierar avståndet mellan tvärbindningar i gelén (här myosinaggregaten), en bra uppskattning också av gelporstorleken. Maskstorleken kan extraheras direkt från (2D)fluorescensbilderna och utvärderas utifrån det geometriska medelvärdet av avstånden mellan par av motsatta aktinbuntar i en gelpor (figur 4B). Eftersom nätet är isotropt fram till kontraktionsdebuten är de genomsnittliga maskstorlekarna i vertikal (dvs. över tjockleken) och laterala (längs radien) desamma, ξ 0, = ξ 0,llEquation 23 = ξ 0 (= 67 μm). Eftersom aktinbuntarna förblir raka under sammandragningen krymper nät- och porstorlekarna i proportion till förändringarna i geltjocklek och diameter. För det nuvarande experimentella systemet initieras den (radiella) kontraktionen i planet efter att den vertikala sammandragningen praktiskt taget slutar (visas inte), så att radiell kontraktion fortskrider vid en konstant geltjocklek mindre än den ursprungliga tjockleken med en faktor ~ 0,3. Följaktligen, medan maskstorleken inom kontraktionsplanet, ξ ll (t) = r (t) / R, minskar under radiell sammandragning, där r (t) är gelens radie vid tiden t, är den genomsnittliga maskstorleken i vinkelrät riktning konstant, ξEquation 23 = 20μm23. Dessa värden för mesh/porstorlekarna används för att utvärdera gelens elastiska modul, κ, och friktionskoefficient, γ, enligt beskrivningen nedan (Syfte [iii], figur 6).

Syfte ii)

Detta mål innebär att visa att ett utåtriktat lösningsmedelsflöde genereras av myosinkontraktilitet. För att spåra lösningsmedelsflödet tillsätts fluorescerande pärlor till aktomyosinlösningen. Pärlorna passiveras för att minska interaktionen mellan de rörliga pärlorna och actomyosin-nätverket. Totalt inkuberas 1 μL pärlor (Table of Materials) med 5 μm G-aktin i 20 minuter vid rumstemperatur, och överskott av G-aktin avlägsnas genom centrifugering (Table of Materials, se protokollavsnittet för detaljer). Detta steg upprepas med 10 mg · ml-1 BSA (Table of Materials). Pärlorna tillsätts till proteinlösningen vid en slutlig utspädning av 1:10 000 v/v. Eftersom syftet är att låta pärlorna röra sig fritt över gelporerna är det viktigt att anpassa pärlornas diametrar till gelporstorleken, så att deras storleksförhållande alltid är <<1. Som sådan används pärlor med en diameter på 2 300 nm för att analysera de inledande och mellanliggande stadierna av sammandragning (figur 5A, B) när den genomsnittliga porstorleken är större än 15 μm och pärlor med en diameter på 200 nm när porstorleken är mindre (figur 5D-G). Kulornas masscentrumposition extraheras för varje gång, t, (x(t), y(t)))pärla, med hjälp av en standardpartikelspårningsalgoritm (Table of Materials), från vilken banan (figur 5B) och lokal stränghastighet, Equation 13, kan härledas. Pärlorna, och därmed det penetrerande lösningsmedlet, rör sig i genomsnitt i den utåtriktade radiella riktningen (figur 5A,B), medan gelen dras inåt, vilket framgår av analys av partikelbildsvelocimetri (PIV) (se de gröna pilarna i figur 6A). Denna radiella rörelse kan vidareutvecklas genom att extrahera de lokala kulornas radialhastighet, νr, som utvärderas genom att projicera den lokala stränghastigheten på den radiella riktningen definierad av enhetsvektorn, , som förbinder gelcentret (x 0, Equation 15y0) och pärlans masscentrum vid tiden t: Equation 17 där Equation 18

Data visar att när pärlorna rör sig utåt från gelcentret ökar deras hastigheter initialt och de saktar sedan ner när de närmar sig gelgränsen (figur 5C). I synnerhet kan stränghastigheten vara 20 gånger större än gelens radiella kontraktionshastighet (blå kurva i figur 5C). De fyllda cirklarna markerar den tid pärlorna lämnar gelén. Pärlorna fortsätter att röra sig efter att ha lämnat gelgränsen under en tid. Denna rörelse kan inte bero på tröghetseffekter, eftersom Reynold-talet är <10-4. Den radiella pärlhastigheten minskar med tiden samtidigt med minskningen av gelkontraktion; I synnerhet, när gelens radiella kontraktionshastighet har minskat avsevärt, fluktuerar kulans hastighet avsevärt.

För att testa om dessa fluktuationer beror på aktomyosinens porösa struktur spårar nätverket pärlornas rörelse med en högre rumslig upplösning, vilket är möjligt när gelens sammandragning har avtagit avsevärt (figur 5D-F). Kulornas bana är verkligen slingrig (figur 5D, E), med betydande fluktuationer i pärlornas lokala hastighet, vilket återspeglar gelens porösa struktur - det vill säga den lokala hastigheten är snabbast nära porcentret och långsammast i närheten av en aktinbunt (figur 5F).

Slutligen visar beräkning av gelhastighet-lösningsmedelshastighetskorrelationsfunktionen att vätskeflödet lokalt riktas motsatt den kontraherande gelén. Med hjälp av lokala ljuspunkter i gelén som fiduciella markörer kan deras masscentrumposition för varje tidpunkt, t, (x(t), y(t))gel, beräknas och den lokala gelhastigheten kan härledas: Equation 20. Sedan, för varje sträng och en närliggande punkt i gelen, beräknas den lokala parkorrelationen mellan pärlhastighet och gel för att extrahera vinkeln, θ, mellan de två vektorerna: Equation 22, där Equation 23 och Equation 24 är de lokala hastigheterna (storleken) för pärlan respektive gelén. Data visar att oberoende av strängens position i gelporen, lokalt, riktas vätskeflödet i motsatt riktning med avseende på gelén (figur 5G). Sammantaget visar resultaten att ett utåtriktat vätskeflöde genereras av myosinkontraktilitet, vilket förväntas för ett poroelastiskt aktivt material 3,7,23,30.

Syfte iii)

Detta mål innebär att visa att spänningsavslappning kännetecknas av en effektiv poroelastisk diffusionskonstant, D, som beror på nätverkets elastiska modul, porositet och lösningsmedelsviskositet. Först kvantifieras den laterala (i plan) hastigheten hos den kontraherande gelen (figur 6A). Först binariseras fluorescensbilderna och det gelprojicerade området vid varje tidpunkt t, A (t), extraheras. Därefter beräknas Equation 26 gelradien (figur 6B). Från detta härleds den radiella kontraktionshastigheten vid tidpunkten t,,Equation 27 som beskriver gelkanthastigheten (figur 6C). Kanthastigheten visar en typisk temporal utvecklingsprofil som kännetecknas av en initial linjär fas, där kanthastigheten ökar med konstant hastighet, tills en maximal hastighet, ν max, Equation 28uppnås vid tiden t max. Hastigheten avtar sedan exponentiellt med en karakteristisk avkopplingstid, τ, tills ett mekaniskt stabilt tillstånd uppnås (figur 6C). Rmaxär gelradien i början av den avslappningsfasen. 

För ett poroelastiskt material, avkopplingstiden Equation 33, där Equation 34 är en effektiv poroelastisk diffusionskonstant, κ är en effektiv elastisk gelmodul och γ är en effektiv friktionskonstant som står för rörelsen av den vattenhaltiga lösningen genom aktingelporerna. Den elastiska modulen har energienheter per volymenhet och är omvänt proportionell mot volymen av en enhetscell i gelén, bestämd av avståndet mellan tvärbindningar eller maskstorleken, så att Equation 35. Friktionskoefficienten, γ, beror på porfasetten vinkelrätt mot lösningsmedelsflödet. För gelkontraktion i plan är den relevanta porfasetten , och följaktligen friktionskoefficienten Equation 37, där η är Equation 36lösningsmedelsviskositeten31,32. Sammantaget får vi följande relation: Equation 39, där den relevanta porstorleken Equation 40 i plan utvärderas vid tmax. Sammantaget får Equation 41vi , vilket innebär att avkopplingstiden ska skala linjärt med lösningsmedelsviskositet23.

För att testa om detta förhållande följs upprepas experimenten med olika mängder glycerol. Användningen av glycerol är fördelaktig eftersom den inte förväntas påverka aktiviteten hos proteiner, särskilt myosinmotorerna. Dessutom finns korrelationer mellan viskositeten hos vattenglycerollösningar och mängden tillsatt glycerol tillgängliga i litteraturen28. Dessa korrelationer visar att en ökning av glycerolviktprocenten från 0% till 34% leder till en proportionell ökning av vatten-glycerollösningens viskositet från η ω till 2,76 η ω, där η ωär vattenviskositeten vid 20 °C. I detta glycerolområde och för samma initiala falldiameter, 2R = 2 800 μm, ökar viskositeten varaktigheten av nätverkspolymerisations- och självorganisationsfaserna, även om den linjära accelerationen och den maximala radiella kontraktionshastigheten (νmax) är ungefär oförändrade. Detta tyder på att både nätverksomorganisation (porositet) och myosinaktivitet inte påverkas av lösningens viskositet23, och effekten av lösningsmedelsviskositet bör väsentligen återspeglas i den tid det tar för de elastiska spänningarna att slappna av. Faktum är att avkopplingstiden visar ett linjärt beroende av lösningens viskositet (figur 6D), vilket innebär att skalningsförhållandet härlett ovan följs, vilket ytterligare bekräftar systemets poroelastiska natur.

Figure 1
Figur 1: Schematisk beskrivning av de tre huvudstegen i ytbehandlingsförfarandet för glastäckglas . (i) Rengöring av glasytor (Piranha-behandling) och hydrofilisering, (ii) ytsilanisering, och (iii) passivering med mPEG-mal. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Passivering av glastäckglas. (A) Piranha rengöring och silanisering utförs i en 400 ml bägare med hjälp av en hemmagjord polytetrafluoretylenhållare bestående av 12 linjära spår. (B) Ytpassivering utförs i en parafilmdragerad petriskål. Varje täckglas inkuberas med 1 ml 5 kDa mPEG-mal vid 4 mg·ml−1 i 1x PBS (Table of Materials) i 1 timme vid 22 °C. Det hydrofoba parafilmskiktet säkerställer att den hydrofila PEG-polymerlösningen förblir begränsad till glasytan under hela inkubationstiden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kör ett experiment - den hemlagade provhållaren. Experiment körs i en hemlagad provhållare som passar dimensionerna i ett standardmikroskopsteg. (A) En smord parafilm spacer med tjockleken h (~ 150 μm) placeras på ett PEG-passiverat täckglas, och detta täckglas placeras i provhållaren. B) Actomyosinlösningen bereds på is i ett Eppendorfrör och 1,1 μl av denna lösning placeras på täckglaset. sedan (C) placeras ett andra PEG-passiverat täckglas ovanpå det, och (D) provhållaren skruvas fast för att begränsa droppen, som antar en skivliknande form. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Poroelasticitetsmål (i). Actomyosin-nätverket beter sig som ett elastiskt material. (A) Schematisk representation av ett aktomyosinnätverk. (B) Bildandet av Actomyosin-nätverket. Fluorescensmikroskopibilder visar att aktinfilamenten spontant kärnar och polymeriseras till ett isotropt sammankopplat nätverk som grovnar med tiden och så småningom kontraherar makroskopiskt. Nätverkets porositet kännetecknas av nätverkets maskstorlek, ξ (dubbelpil). (C–E) Actomyosin-nätverkskontraktion drivs av glidning av aktinfilamentbunt. (C) Nätverkskontraktion initieras vid gelperiferin ("P") och fortplantar sig inåt i gelbulken. De vita pilarna visar sammandragningsriktningen. Gelcentret är märkt med ett "C". De fluorescerande bilderna visar att myosinmotoraggregaten (561 nm, röda prickar) är inbäddade i aktinnätverket (488 nm, grönt) och förblir fästa vid det under hela nätverkskontraktionen. (D) Aktinfilamentbuntarna förblir raka under nätverkskontraktion. Förhållandet mellan konturlängden, l konten och avståndet från ände till ände, lfrån ände till ände, som en funktion av tiden. (E) Fördelning av förhållandet mellan konturlängden och avståndet från ände till ände vid t = 316 s (fast rött) och t = 327 s (randigt, grått). Infälld: konturlängd (blå) och end-to-end-avstånd (vit) för en typisk bunt. Villkor: (B,C,E[infälld]): Bilder tas på ett inverterat fluorescerande mikroskop med en EMCCD-kamera och ett 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-luftmål i vanligt läge (B) och i dubbelt bildläge efter bildöverlagring (C,E[infälld]). Skalstaplarna är (B,C) 100 μm och (E[infälld]) 50 μm. Denna siffra har återgivits med tillstånd från Ideses et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Poroelasticitetsmål (ii). Ett utåtriktat lösningsmedelsflöde genereras av myosinmotorkontraktilitet. (A) Avbildning av gelen vid låg förstoring vid mellanliggande kontraktionssteg: samtidig fluorescensavbildning av ett kontrakterande aktinnätverk (488 nm, vänster) och 2 300 nm fluorescerande pärlor tillsatta till lösningen (561 nm, höger) som en funktion av tiden. Cirklarna markerar positionerna för fyra pärlor. Pilarna markerar pärlans rörelses globala riktning. (B) Banorna för nio utvalda pärlor visas. Pilarna markerar den globala radiella riktningen för pärlornas rörelse. Det omringade korset betecknar gelens centrum (x0,y0) (C) Lokal radiell stränghastighet νr (öppna cirklar) och (radiell) gelkanthastighet (blå prickar) mot tiden. De fyllda cirklarna anger den tid en given pärla lämnar gelgränsen. (D-F) Lösa nätverksporositeten och lösningsmedlets rörelse över gelporerna vid avancerade kontraktionsstadier. d) Epifluorescensbilder av den sammandragande gelen och fluorescerande pärlor med diametern 200 nm tillsatta till lösningen. Både aktin och pärlor är upphetsade vid 488 nm. De röda cirklarna följer en pärlas position med tiden. Den grå linjen indikerar gelgränsen. E) Strängens bana enligt (D). I det visade fältet kontraherar gelén i genomsnitt mot botten. Koordinaterna mäts i förhållande till kamerans ursprung. (F) Vulstens lokala hastighet återspeglar gelens porösa struktur. Överst: Lokal pärlhastighet (öppna cirklar), lokal gelhastighet (grå cirklar) och gelkanthastighet (blå cirklar) kontra tiden. Nederst: Ögonblicksbilder visar strängens position för valda tider. Pärlan är markerad med en röd cirkel. Den streckade linjen markerar den tid då pärlan lämnar gelén. (G) Fördelning av vinklar mellan den lokala gelen och lokala stränghastigheter. Villkor: Bilder förvärvas på ett inverterat fluorescerande mikroskop med en EMCCD-kamera och (A) ett 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-mål och (D,F) ett 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-mål. Skalstängerna är (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) och 50 μm. Denna siffra har återgivits med tillstånd från Ideses et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Poroelasticitetsmål (iii). Stressavslappning kännetecknas av en effektiv poroelastisk diffusionskonstant. (A) Fluorescensbilder uppifrån av en kontraherande aktomyosigel vid låg förstoring från blandningstiden upp till steady state. Hastighetsfältet (gröna pilar) extraheras från PIV-analysen. Bilderna förvärvas på ett inverterat fluorescerande mikroskop med en EMCCD-kamera och ett 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-mål. Excitationsvåglängden är 488 nm (aktin). Skalstången är 500 μm. (B) Gelradie och (C) radiell kontraktionshastighet, Equation 53 (dvs. gelkanthastigheten kontra tiden). A betecknar accelerationen, VMax betecknar maxhastigheten och τ är en karakteristisk avkopplingstid. (D) Actomyosin-nätverken beter sig som ett poroelastiskt aktivt material. Equation 55 och lösningsmedelsviskositet, η, jämfört med glycerolviktprocent (viktprocent). Kvantiteterna normaliseras till sina värden vid 0 vikt% glycerol. Gelens initialradie är R = 1 400 μm. Felstaplarna är standardavvikelserna för experimentvärdena. Denna siffra har återgivits med tillstånd från Ideses et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här används en in vitro-metod för att karakterisera mekaniken hos poroelastiska aktomyosingeler som ett modellsystem för cellcytoskelettet och, mer allmänt, för cellcytoplasman, som har visat sig bete sig som ett poroelastiskt material 3,5. Reologin hos cellcytoskelettet (cytoplasman) har karakteriserats av en poroelastisk diffusionskonstant, som dikterar hur lång tid det tar för den intracellulära cytosoliska vätskan att omfördela sig inom cellen efter applicerad mekanisk stress. Celler har föreslagits att använda denna mekanism för att reglera sin form5.

Motiverade av dessa fynd har vi utvecklat ett ramverk för att studera poroelasticitet in vitro. Med hjälp av det föreslagna modellsystemet ger vi insikter i hur myosinkontraktilitet bidrar till uppkomsten av ett vätskeflöde och hur nätverkshastighet och lösningsmedelshastighet, riktning och hastighet korrelerar i tid och rum. Genom detta visar vi att nätverket och det inbäddade lösningsmedlet är sammankopplade och inte kan betraktas som separata objekt. Vi beskriver experimentupplägget och tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att förbereda gelerna och köra ett experiment. Ett detaljerat ramverk för datakvantifiering presenteras också. Det föreslagna ramverket kan enkelt anpassas för att studera poroelasticitet i en mängd olika experimentella uppställningar och system, oavsett specificiteten hos det experimentella systemet som undersökts.

Vi validerar poroelasticiteten hos aktomyosinnätverken genom att analysera förändringarna i tidsskalan för stressavslappning. Vi väljer att demonstrera detta genom att variera viskositeten hos mediet genom att tillsätta olika mängder glycerol till aktomyosinlösningen. Fördelen med att använda glycerol är att den inte påverkar porositeten och strukturen hos nätverken, och därmed är den enda effekten på stressavslappning ökningen av friktionen mellan den rörliga lösningen och gelporerna23. Förändringar i nätverksporositet skulle ha skapat en ytterligare komplikation, eftersom både den elastiska modulen och nätverksporstorleken påverkar avkopplingstiden på ett icke-linjärt sätt 23,31,32.

Att köra framgångsrika experiment kräver passivering av glastäcket med en inert polymer. Detta steg är avgörande. Det förfarande som används här för glaspassivering kan ersättas med andra förfaranden om passiveringens kvalitet bevaras33,34. Defekt ytpassivering kan ge upphov till massiv proteinvidhäftning, vilket kan hämma nätverksmontering. Glaspassivering är också viktigt för att förhindra interaktionen mellan den kontraherande gelén och glasytorna. Detta skulle leda till ytterligare en friktionsterm, utöver den vätskegelfriktion som behandlas här, vilket skulle vara mycket svårare att uppskatta eller kvantifiera. Bortsett från ytpassivering kräver framgångsrika experiment användning av färskt aktin. Dessutom är motorernas aktivitet också avgörande, och beredningen av färska satser myosin bör upprepas var 3-4: e månad.

Sammantaget har detta experimentella tillvägagångssätt visat sig vara framgångsrikt för att studera poroelasticitet in vitro. En begränsning av det för närvarande använda experimentella förfarandet är hur man kontrollerar de initiala geldimensionerna mer robust. Ett alternativ skulle vara att använda förformade kamrar med kontrollerbara dimensioner. Användningen av förformade kamrar skulle också göra det möjligt för forskaren att bättre kontrollera systemstorleken utan också att enkelt ändra systemets geometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dina Aranovich för proteinrening och märkning. G.L. är tacksam mot Israels ministerium för vetenskap, teknik och rymd för Jabotinskys doktorandstipendium. A.B.G. är tacksam mot Israel Science Foundation (bidrag 2101/20) och till ministeriet för vetenskap och teknik - staten Israel (bidrag 3-17491) för ekonomiskt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich Company 175617 Stored under Argon atmosphere at 4 °C 
Acetic acid Bio-Lab ltd 1070521
Alexa-Fluor 488 Invitrogene A10254 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
Alexa-Fluor 647 Invitrogene A20347 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
BSA Sigma -Aldrich Company A3059 Stored at 4 °C 
Catalase Sigma -Aldrich Company C9322 The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips Mezel-glaser CG2222-1.5 Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase Roche Life Science Products 10736988001 Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate Roche Life Science Products 10621714001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT Roche Life Science Products 10708984001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System  Photometrics DV2-CUBE
EGTA MP Biomedicals 195174
EM-CCD Camera Andor Technology Ltd DV 887
EM-CCD Camera Photometrics Evolve Delta
Ethanol Bio-Lab ltd 525050300
Flourescence Lamp Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres Polysciences 17151-10 200 nm diameter
Glucose ICN Biomedicals Inc 194024 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase Sigma-Aldrich Company G7141 Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol ICN Biomedicals Inc 800687
Glycine MP Biomedicals 808822
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich Company 216763 Stored at 4 °C 
KCl EMD Millipore Corp. 529552
Methanol Bio-Lab ltd 1368052100
MgCl2 EMD Millipore Corp. 442615
Microscope Leica Microsystems DMI3000
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-5k  Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres Spherotech FP-2056-2  2300 nm diameter
Objective (10x) Leica Germany HC PL AP0 UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x) Leica Germany 506304  Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven WTC Binder
Parafilm Amcor PM-996
PBS Buffer Sigma-Aldrich Company P4417
Shutter Driver Vincet Associates VMM D1
Silica gel Merck 1.01907.5000
Sonicator Elma Elmasonic P
Sulfuric acid Carlo Erba reagents 410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System Photometrics
TRIS MP Biomedicals 819620
UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E Gilson FD10001 1–10 uL
MATLAB R2017b MathWorks Data quantification 
MetaMorph  Molecular devices Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Tags

Bioteknik utgåva 193 aktin myosin aktiva kontraktila nätverk aktomyosin poroelasticitet vätskeflöde cytoskelett-cytosolhastighetskorrelation
Mekaniken i (poro-)elastiska kontraktila aktomyosinnätverk som modellsystem för cellcytoskelettet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S.,… More

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S., Bernheim-Groswasser, A. The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (193), e64377, doi:10.3791/64377 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter