Summary
In questo lavoro, un approccio di ricostituzione in vitro è impiegato per studiare la poroelasticità dei gel di actomiosina in condizioni controllate. Viene quantificata la dinamica del gel di actomiosina e del solvente incorporato, attraverso la quale viene dimostrata la poroelasticità della rete. Discutiamo anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.
Abstract
Le cellule possono cambiare attivamente le loro forme e diventare mobili, una proprietà che dipende dalla loro capacità di riorganizzare attivamente la loro struttura interna. Questa caratteristica è attribuita alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori di miosina e proteine accessorie che presentano proprietà di contrazione intrinseca. La visione solitamente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico. Tuttavia, questo modello non può sempre spiegare i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un'immagine che descrive il citoscheletro come un materiale attivo poroelastico, una rete elastica incorporata con citosol. I gradienti di contrattilità generati dai motori della miosina guidano il flusso del citosol attraverso i pori del gel, che deduce che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati. Una caratteristica principale della poroelasticità è il rilassamento diffusivo delle tensioni nella rete, caratterizzato da un'efficace costante di diffusione che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità e dalla viscosità del citosol (solvente). Poiché le cellule hanno molti modi per regolare la loro struttura e le proprietà dei materiali, la nostra attuale comprensione di come la meccanica del citoscheletro e la dinamica del flusso del citosol sono accoppiate rimane poco compresa. Qui, un approccio di ricostituzione in vitro viene impiegato per caratterizzare le proprietà materiali dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello per il citoscheletro cellulare. La contrazione del gel è guidata dalla contrattilità motoria della miosina, che porta all'emergere di un flusso del solvente penetrante. Il documento descrive come preparare questi gel ed eseguire esperimenti. Discutiamo anche di come misurare e analizzare il flusso di solvente e la contrazione del gel sia su scala locale che globale. Vengono fornite le varie relazioni di scala utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse le sfide sperimentali e le insidie comuni, inclusa la loro rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.
Introduction
Le cellule viventi hanno proprietà meccaniche uniche. Oltre alla capacità di reagire passivamente alle forze applicate, sono anche in grado di generare attivamente forze in risposta a stimoli esterni1. Queste caratteristiche, che sono essenziali per una varietà di processi cellulari, in particolare durante la motilità cellulare, sono principalmente attribuite alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori molecolari della miosina e proteine accessorie. Queste reti di actomiosina mostrano proprietà intrinseche di auto-organizzazione e contrazione guidate dalle proteine motorie della miosina, che reticolano i filamenti di actina e generano attivamente stress meccanici nella rete alimentata dall'idrolisi ATP2.
Numerosi studi sperimentali e teorici sono stati condotti per studiare le proprietà materiali del citoscheletro3. L'opinione comunemente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico4. Ciò significa che su brevi scale temporali, il citoscheletro si comporta come un materiale elastico e, su lunghe scale temporali, si comporta come un fluido viscoso a causa delle proteine reticolanti e del distacco motorio della miosina (e del riattaccamento), che consente alla rete di ruotare dinamicamente. In molte situazioni, tuttavia, il modello viscoelastico non può descrivere i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un quadro che descrive il citoscheletro e, più in generale, il citoplasma cellulare descritto come un materiale attivo poroelastico 5,6. Due caratteristiche principali caratterizzano questi tipi di materiali. (i) La prima caratteristica principale è la generazione di un flusso del citosol penetrante (il "solvente") attraverso i pori del gel da gradienti di contrattilità guidati dai motori della miosina, che sono alla base di processi come il blebbing cellulare7, la motilità8 e le oscillazioni della forma cellulare9. L'emergere di tali flussi citosolici può essere locale, per il blebbing, o globale, come nella motilità cellulare. In quest'ultimo caso, le sollecitazioni contrattili applicate nella parte posteriore della cellula guidano il flusso del liquido citosolico verso il fronte cellulare, che reintegra il pool proteico necessario per l'assemblaggio dei lamellipodi8. (ii) La seconda caratteristica principale è che il rilassamento delle sollecitazioni è diffusivo ed è caratterizzato da una costante di diffusione efficace, che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità del gel e dalla viscosità del solvente5. La costante di diffusione poroelastica determina la velocità con cui il sistema risponde a una sollecitazione applicata. Costanti di diffusione più elevate corrispondono a una più rapida ridistribuzione dello stress. Questo, a sua volta, determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracellulare a essere ridistribuito all'interno della cellula a seguito di stress meccanico applicato, sia esterno che interno, come le sollecitazioni contrattili attive generate dai motori della miosina. Questi esempi, quindi, dimostrano che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati e non possono essere trattati separatamente3.
Poiché le cellule possono regolare le loro proprietà meccaniche in vari modi, l'interazione tra meccanica della rete e dinamica del flusso dei fluidi rimane poco compresa. Un potente approccio alternativo è quello di utilizzare sistemi ricostituiti in vitro che consentono il pieno controllo dei vari costituenti microscopici e dei parametri del sistema, il che rende questi sistemi modello ottimali per l'analisi fisica10,11. Questo approccio è stato impiegato con successo per studiare l'impatto della composizione proteica e della geometria del sistema sulla motilità basata sull'actina 12,13,14,15,16,17,18, il pattern 2D delle reti di actomiosina 19,20,21,22, e l'interazione tra contrattilità della rete e fluidodinamica dei gel di actomiosina poroelastici, che è al centro del presente articolo23.
In questo manoscritto, la preparazione di reti di actomiosina elastica contrattile di dimensioni controllabili e proprietà del materiale è discussa sulla base del lavoro di Ideses et al.23. Viene analizzata e quantificata la dinamica del gel contante e del solvente drenato, attraverso la quale viene dimostrato che questi gel di actomiosina possono essere descritti come un materiale attivo poroelastico. Lo studio dell'effetto della viscosità del solvente sulla diffusività dello stress conferma ulteriormente la natura poroelastica di queste reti. Vengono fornite le varie relazioni di ridimensionamento utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza dei risultati sperimentali per il citoscheletro cellulare.
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Protocol
1. Trattamento superficiale del vetro e passivazione:
NOTA: Questa sezione include tre fasi principali (vedere la Figura 1): (i) pulizia e idrofilizzazione, (ii) silanizzazione e (iii) passivazione superficiale.
- Pulizia e idrofilizzazione
- Utilizzare la soluzione Piranha per la pulizia della superficie del vetro.
NOTA: La soluzione di Piranha è una miscela di 30% H 2 O 2 e 70% H2SO4 (Tabella dei materiali). Il suo obiettivo principale è quello di rimuovere le contaminazioni organiche dalle superfici di copertura ed esporre i gruppi OH sulla superficie del vetro. In questo modo, la superficie del vetro diventa idrofila. - Posizionare 10-12 #1.5 (22 mm x 22 mm) vetrini di vetro (Table of Materials) in un supporto in politetrafluoroetilene fatto in casa (area di base: 5,5 cm x 5,5 cm). Trasferire il supporto in politetrafluoroetilene in un becher da 400 ml (tabella dei materiali) e incubarlo con 300 ml di soluzione di Piranha per 2 ore. Fai questo passaggio sul ghiaccio e in una cappa chimica.
NOTA: Il palo in politetrafluoroetilene avvitato alla base del supporto è lungo 12 cm, più lungo del becher (11 cm), il che consente il trasferimento/estrazione sicuro del supporto da/verso la soluzione di Piranha. Poiché la soluzione di Piranha può ancora essere altamente reattiva e molto calda, è imperativo interrompere la reazione. Il modo più semplice per fermare la reazione è versare la soluzione di Piranha in acqua (di rubinetto) per ottenere una diluizione 50x (almeno). La soluzione può quindi essere scartata in modo sicuro. Non conservare mai la soluzione Piranha usata in una bottiglia di vetro chiusa - questo potrebbe finire in un'esplosione della bottiglia. - Trasferire il supporto in politetrafluoroetilene in un becher pulito riempito con acqua fresca bidistillata (DDW) per lavare il Piranha in eccesso dai vetrini di copertura.
- Trasferire il becher in un bagno di sonicazione (Table of Materials) e sonicare a 80 Hz a piena potenza per 10 minuti a 25 °C. Ripeti questo passaggio altre due volte con DDW fresco. Usa DDW fresco in ogni momento.
- Utilizzare la soluzione Piranha per la pulizia della superficie del vetro.
- Silanizzazione
- Trasferire il supporto in un becher pulito (400 ml) riempito con 300 ml di metanolo puro (Table of Materials) e quindi in un bagno di sonicazione (Table of Materials). Sonicare a 80 Hz a piena potenza per 30 minuti a 25 °C.
- Dopo la sonicazione, trasferire il supporto in una soluzione silana preparata utilizzando 15 ml di DDW, 3,1 ml di acido acetico (Tabella dei materiali), 340 ml di metanolo e 7,6 ml di silano ((3-Mercaptopropil) trimetossisilano) (Tabella dei materiali). Sigillare il becher con parafilm e conservarlo in frigorifero a 4 °C per una notte.
NOTA: La preparazione e la manipolazione della soluzione silana devono essere eseguite in una cappa chimica. Dopo la fase di silanizzazione, mettere la soluzione silana usata (rifiuti) in una bottiglia di vetro dedicata all'interno della cappa chimica. - Il giorno successivo, trasferire il supporto in un becher pulito riempito con 300 ml di metanolo puro per 15 s. Quindi, trasferire il supporto in un becher pulito, non prima di aver asciugato il fondo del supporto in politetrafluoroetilene per rimuovere il metanolo in eccesso. Trasferire il becher nel forno (Table of Materials) per asciugare i vetrini per 5 minuti a 120 °C.
- Passivazione superficiale con un polimero inerte
- Ottenere la passivazione superficiale incubando i vetrini di copertura con un polimero inerte (Table of Materials). Per ogni esperimento, prendere due vetrini e metterli in una capsula di Petri rivestita con uno strato di parafilm inizialmente pulito con etanolo (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (Tabella dei materiali).
- Incubare ciascun foglietto di copertura con 1 mL di un 4 mg·mL−1 5 kDa peso molecolare metossipolietilenglicole maleimmide (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Tabella dei materiali) in 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (Tabella dei materiali) per 1 ora a 22 °C.
NOTA: il posizionamento dei vetrini su uno strato di parafilm idrofobo confina la soluzione polimerica di PEG idrofilo alla superficie del vetrino. Il tempo di incubazione è fondamentale per ottenere una passivazione ottimale. Utilizzare tempi di incubazione compresi tra 45 min e 2 h. Al di sopra di questo tempo di incubazione, la superficie dei vetrini di copertura può deteriorarsi, portando all'adesione delle proteine e alla perdita di trasparenza. - Al termine del processo di incubazione, sciacquare ogni coprivetrino con 5 ml di DDW e asciugare con un flusso di N2 (gas). Non asciugare i vetrini sotto vuoto. Poiché i vetrini devono essere tenuti bagnati dopo la passivazione, posizionare immediatamente 1 mL di 10 mM Tris sulle superfici pegilate. Utilizzare i coprivetrini entro 2 ore.
NOTA: I vari passaggi devono essere eseguiti in una camera a flusso laminare per evitare la contaminazione della superficie del vetro.
2. Purificazione delle proteine
- Purificare la G-actina dalla polvere di acetone del muscolo scheletrico di coniglio utilizzando il metodo di filtrazione del gel24.
- La purificazione dell'actina richiede 1 settimana. Conservare la G-actina purificata in G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP e 1 mM DTT) e conservarla su ghiaccio. Utilizzare la soluzione entro 2 settimane.
NOTA: Sostituire il ghiaccio ogni due giorni. - Etichettare l'actina con un colorante fluorescente modificato con maleimmide16 (Tabella dei materiali). Purificare la GST-fascina secondo il metodo di Ono et al.25. Flash-freeze di entrambe le proteine nel liquido N2 e conservarle a -80 °C.
- La purificazione dell'actina richiede 1 settimana. Conservare la G-actina purificata in G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP e 1 mM DTT) e conservarla su ghiaccio. Utilizzare la soluzione entro 2 settimane.
- Utilizzare un protocollo standard per purificare la miosina II dal muscolo scheletrico del coniglio26. Il tampone purificato per miosina II (dimeri) comprende 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl e 35% p/v di saccarosio. Congelare la miosina nel liquido N2 e conservare a -80 °C.
NOTA: L'alta concentrazione di KCl mantiene i motori della miosina in forma dimerica, mentre l'alta percentuale di saccarosio assicura che l'attività dei motori non sia ostacolata dal congelamento. Utilizzare una pipetta dedicata per la gestione dei fluidi viscosi quando si lavora con soluzioni madre di miosina II (Tabella dei materiali).- Etichettare i dimeri di miosina II con un colorante fluorescente (Table of Materials) a coppie di residui di cisteina ingegnerizzati19,27. Utilizzare un mutante RLC di ventriglio di pollo A a tale scopo26. Congelare la miosina II marcata nel liquido N2 e conservare a -80 °C.
NOTA: Questa procedura di etichettatura assicura che la miosina marcata sia attiva come proteina nativa della miosina II.
- Etichettare i dimeri di miosina II con un colorante fluorescente (Table of Materials) a coppie di residui di cisteina ingegnerizzati19,27. Utilizzare un mutante RLC di ventriglio di pollo A a tale scopo26. Congelare la miosina II marcata nel liquido N2 e conservare a -80 °C.
- Utilizzare uno spettrofotometro UV-Vis (Table of Materials) per misurare l'assorbanza delle soluzioni proteiche stock e dedurre le concentrazioni proteiche con la legge di Beer-Lambert utilizzando i seguenti coefficienti di estinzione: G-actina (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascina (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), dimero della miosina II (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), e il mutante RLC A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.
3. Preparazione del campione
NOTA: Polimerizzare i monomeri di actina in presenza di grandi aggregati di motori di miosina II e del forte reticolante passivo fascin per produrre reti di actomiosina elastiche macroscopicamente contrattili19,23. L'aggiunta di sfere fluorescenti alla soluzione consente di tracciare il flusso di solvente durante la contrazione del gel.
- Soluzione proteica ("actomyosin")
- Ad eccezione della G-actina, mantenere le proteine a -80°C in piccole aliquote e scongelarle a 37 °C prima dell'uso. Il volume totale della soluzione di actomiosina è di 40 μL.
- Preparare la soluzione miscelando 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, un sistema rigenerante ATP (0,5 mg·mL−1 creatinchinasi e 5 mM creatina fosfato), 200 μM EGTA (chelati ioni Ca2+), una soluzione anti-sbiancamento (0,1 mg·mL−1 glucosio ossidasi, 0,018 mg·mL−1 catalasi e 5 mg·mL−1 glucosio), 5 μM di G-actina, 280 nM GST-fascina e 1,67 nM di miosina II. La percentuale di G-actina marcata è del 5% (percentuale molare).
NOTA: Utilizzare una bassa percentuale di G-actina marcata per evitare la saturazione del segnale fluorescente nelle fasi avanzate della contrazione del gel.
- Preparazione degli aggregati motori della miosina II
- Aggiungere i motori della miosina alla soluzione proteica sotto forma di aggregati. Per formare grandi aggregati di miosina (150 dimeri di miosina/aggregato), diluire la soluzione madre di miosina con 10 mM Tris pH 7,4 per raggiungere una concentrazione finale di 25 mM KCl.
- Mantenere la soluzione di miosina diluita per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi trasferirla sul ghiaccio fino all'uso. I motori sono completamente attivi fino a 2 ore.
- Misurazione del flusso di solvente
- Per monitorare il flusso di solvente attraverso i pori del gel, aggiungere le sfere fluorescenti alla soluzione di actomiosina. Ridurre l'interazione tra le perle e la rete di actomiosina passivando le perle. In pratica, incubare 1 μL di perline (Table of Materials) con 5 μM di G-actina per 20 minuti a RT, quindi rimuovere l'eccesso di G-actina mediante centrifugazione (Table of Materials) (condizioni: 6.000 x g per 5 min a 4 °C).
- Ripetere questo passaggio con 10 mg·mL−1 di albumina sierica bovina (BSA) (tabella dei materiali) per bloccare (eventualmente) la superficie rimanente non rivestita. Utilizzare le perle ad una diluizione finale di 1:10.000 vol/vol negli esperimenti.
NOTA: È importante adattare il diametro delle perle alla dimensione dei pori del gel in modo tale che il rapporto granulometria/poro sia <1 in tutte le fasi.
- Effetto della viscosità della soluzione
- Controllare la viscosità della soluzione aggiungendo glicerolo (tabella dei materiali) alla soluzione di actomiosina. L'aggiunta di glicerolo in una percentuale di peso compresa tra 0% e 34% induce un corrispondente aumento della viscosità della soluzione da η ω a 2,76 η ω, dove η ω è la viscosità dell'acqua a 20 °C28.
NOTA: È essenziale utilizzare una pipetta dedicata per la gestione dei fluidi viscosi quando si lavora con glicerolo (Table of Materials).
- Controllare la viscosità della soluzione aggiungendo glicerolo (tabella dei materiali) alla soluzione di actomiosina. L'aggiunta di glicerolo in una percentuale di peso compresa tra 0% e 34% induce un corrispondente aumento della viscosità della soluzione da η ω a 2,76 η ω, dove η ω è la viscosità dell'acqua a 20 °C28.
4. Esecuzione di un esperimento
- Manipolazione del portacampioni fatta in casa
- Prendere uno dei vetrini di copertura passivati PEG, posizionare un distanziatore parafilm ingrassato sopra di esso e posizionarlo nel portacampioni.
NOTA: È possibile sostituire il distanziatore del parafilm con qualsiasi distanziatore.
- Prendere uno dei vetrini di copertura passivati PEG, posizionare un distanziatore parafilm ingrassato sopra di esso e posizionarlo nel portacampioni.
- Preparazione della soluzione di actomiosina
- Preparare la soluzione di actomiosina su ghiaccio in una provetta da microcentrifuga incorporando i vari costituenti microscopici, aggiungendo gli aggregati motori della miosina II e aggiungendo EGTA per ultimo. Mescolare bene la soluzione. L'aggiunta di EGTA avvia la polimerizzazione della rete di actomomisina, che stabilisce l'ora di inizio dell'esperimento.
- Mettere 1,1 μL di quella soluzione sul coprislip montato sul supporto e posizionare il secondo coprivetrino sulla parte superiore. Avvitare il supporto per sigillare il campione. Questo processo schiaccia leggermente la goccia, che adotta una forma simile a un disco. I diametri delle gocce variano tra 2.800-3.000 μm.
- Posizionare il portacampioni sul microscopio e avviare l'acquisizione. Preparare il microscopio in anticipo per ridurre il tempo di acquisizione iniziale. In genere sono necessari 1-2 minuti dopo la miscelazione per avviare l'imaging del campione.
5. Tecniche di microscopia
- Immagini dei campioni utilizzando un microscopio fluorescente invertito (Table of Materials) controllato da un software dedicato (Table of Materials).
- Utilizzare bassi ingrandimenti dell'obiettivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075 (Table of Materials) per visualizzare l'intera area del gel e seguire la sua contrazione macroscopica nel tempo.
- Utilizzare un obiettivo UPlanFL 10x/0.3 Ph1 (Table of Materials) per caratterizzare la porosità e la struttura della rete e per seguire l'auto-organizzazione e la contrazione della rete nel tempo.
NOTA: Questo obiettivo è utile anche per localizzare gli aggregati motori della miosina II all'interno della rete e seguire il movimento delle sfere fluorescenti attraverso i pori del gel. Ingrandimenti più elevati possono essere utilizzati a scapito di un campo visivo ridotto, che è ancora più significativo nella modalità di imaging a due colori (Table of Materials).
- Eccitare i campioni a 488 nm (actina / sfere fluorescenti) e 561 nm (aggregati motori di miosina / sfere fluorescenti). Acquisisci le immagini a 100 ms per fotogramma con software dedicato (Table of Materials) in modalità streaming con una telecamera EMCCD (Electron Multiplying Charge-coupled Device) (Table of Materials).
NOTA: l'intensità della lampada fluorescente (Table of Materials) deve essere mantenuta al valore più basso possibile per evitare la saturazione del segnale durante la contrazione della rete. - Imaging simultaneo a due colori
- Utilizzare questa modalità per due scopi: (i) rilevare la localizzazione degli aggregati motori di miosina all'interno della rete di actina e (i) caratterizzare il flusso di solvente verso l'esterno all'interno e all'esterno durante la contrazione della rete.
- Eccitare i motori actina e miosina II rispettivamente a 488 nm e 561 nm e registrare le immagini simultaneamente su una telecamera EMCCD (Table of Materials) utilizzando un apparato a doppia emissione (Table of Materials). Utilizzare lo stesso sistema di imaging per visualizzare simultaneamente il gel di actina (488 nm) e le sfere fluorescenti (561 nm).
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Representative Results
Per esperimento vengono utilizzati due vetrini di vetro. I vetrini vengono puliti e passivati con polimeri PEG. La passivazione è essenziale per evitare che le proteine solubilizzate aderiscano alle superfici vetrate nelle prime fasi sperimentali e per minimizzare l'interazione della rete di contrazione con le pareti vetrate. L'incapacità di ottenere una buona passivazione può portare a una contrazione inefficiente e, in casi estremi, può persino inibire la formazione di reti di actina.
La figura 1 descrive le tre fasi principali della procedura di trattamento superficiale. Questi passaggi includono quanto segue: (i) pulizia delle superfici e idrofilizzazione utilizzando una soluzione Piranha, che rimuove la contaminazione organica dalle superfici del coprivetrino ed espone i gruppi OH sulla superficie del vetro; (ii) silanizzazione superficiale con (3-Mercaptopropil)trimetossisilano, che mira a legare covalentemente il silano alla superficie del vetro, dove ogni molecola di silano finisce con un gruppo SH; (iii) passivazione con polimeri PEG (mPEG-mal, 5 kDa)-in questa fase, il gruppo maleimmide del polimero PEG interagisce covalentemente con il gruppo SH sul (3-Mercaptopropil)trimetossisilano, con conseguente formazione di un monostrato PEG sulla superficie del vetro.
Per il trattamento e la silanizzazione Piranha, 10-12 vetrini #1.5 (22 mm x 22 mm) vengono collocati in un supporto in politetrafluoroetilene (Figura 2A) e tale supporto viene trasferito in un becher da 400 ml. Per la fase di passivazione, due vetrini di vetro vengono trasferiti su una capsula di Petri rivestita di parafilm (Figura 2B). Il posizionamento dei vetrini su uno strato di parafilm idrofobo assicura che la soluzione polimerica idrofila di PEG rimanga confinata sulla superficie del vetro per tutto il tempo di incubazione. Ogni foglietto viene incubato con 1 mL di 4 mg·mL−1 5 kDa mPEG-mal in 1x PBS per 1 ora a 22 °C (Figura 2B). Per questo peso molecolare e concentrazione del polimero PEG, la passivazione del vetro porta alla formazione di un monostrato PEG, dove ogni polimero PEG è in una conformazione simile a un fungo29. Alla fine del processo di incubazione, ogni coprivetrino viene risciacquato con 5 ml di DDW e asciugato con un flusso di N2 (gas). Se i vetrini di copertura non vengono utilizzati immediatamente, 1 mL di 10 mM Tris deve essere messo sulle superfici pegilate per mantenere le superfici di copertura bagnate. I vetrini vengono essiccati con un flusso di N2 (gas) poco prima di iniziare un esperimento. È meglio usare i coprivetrini entro 2 ore.
Le reti di actomiosina elastica macroscopicamente contrattile si formano mescolando 5 μM di G-actina con 16,7 nM di miosina, che viene aggiunta sotto forma di grandi aggregati (~ 150 dimeri / aggregati di miosina) e 280 nM del fascino del forte reticolante. La soluzione include 1 mM di ATP, che viene mantenuto costante utilizzando un sistema di rigenerazione dell'ATP e una soluzione anti-sbiancamento (vedere i dettagli nella sezione protocollo). Per analizzare il flusso del solvente penetrante, alla soluzione di actomiosina vengono aggiunte perle fluorescenti.
Gli esperimenti vengono eseguiti in un portacampioni fatto in casa, che si adatta alle dimensioni di uno stadio di microscopio standard (Figura 3). Un distanziatore di parafilm ingrassato di spessore h (~150 μm) viene posizionato su uno dei due vetrini di copertura passivati tramite PEG e tale vetrino viene inserito nel supporto del campione (Figura 3A). Quindi, la soluzione di actomiosina viene preparata su ghiaccio in una provetta da microcentrifuga incorporando i vari costituenti microscopici, aggiungendo per ultimo la G-actina, gli aggregati di miosina e quindi EGTA, che innesca la polimerizzazione dell'actina. La soluzione deve essere miscelata bene: questo imposta l'ora di inizio degli esperimenti (t = 0). Immediatamente, 1,1 μL di tale soluzione vengono posizionati sul vetrino di copertura (Figura 3B), il secondo coprivetrino passivato PEG viene posto sopra di esso (Figura 3C) e il supporto viene avvitato per confinare la goccia tra di loro (Figura 3D). Per questo volume di goccia e tipo di distanziatore, il diametro della goccia è di circa 3.000 μm, ma i ricercatori non dovrebbero fare affidamento su questi valori stimati. Lo spessore e il diametro effettivi della goccia devono sempre essere misurati direttamente dalle immagini al microscopio. Per lo spessore, dovrebbe essere usato un microscopio confocale.
Il supporto del campione viene posizionato sul microscopio e l'acquisizione viene avviata. Il microscopio deve essere preparato in anticipo per ridurre al minimo il tempo necessario per iniziare l'acquisizione. In genere sono necessari 1-2 minuti per avviare l'imaging del campione. I campioni vengono eccitati a 488 nm e/o 561 nm e ripresi utilizzando un microscopio fluorescente invertito controllato da un software dedicato. Le immagini devono essere acquisite a una velocità di 100 ms per fotogramma (o meno) in modalità streaming con una telecamera EMCCD. Per visualizzare simultaneamente la rete di actina e gli aggregati motori di miosina, o le sfere fluorescenti nella soluzione, dovrebbe essere utilizzato un sistema a doppia emissione. L'intensità della lampada fluorescente deve essere mantenuta il più bassa possibile per evitare la saturazione del segnale nelle fasi avanzate della contrazione della rete.
Un obiettivo Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 viene utilizzato per caratterizzare la dinamica di contrazione laterale del gel e la direzionalità e la velocità del flusso del fluido sulla scala di lunghezza del gel. Si tratta di immagini a bassa risoluzione utili per seguire le variazioni del raggio del gel nel tempo, da cui si può dedurre la velocità di contrazione radiale (laterale) del gel. Per risolvere la struttura e la porosità della rete, la posizione degli aggregati motori della miosina all'interno della rete e il movimento delle singole sfere fluorescenti attraverso i pori del gel, dovrebbero essere utilizzati obiettivi di ingrandimento più elevati (ad esempio, un obiettivo UPlanFL 10x/0,3 Ph1). È possibile utilizzare anche ingrandimenti più elevati, ma a scapito di un campo visivo ridotto, che è più significativo se viene utilizzata la modalità di imaging a due colori. I dati di microscopia a fluorescenza (2D) devono essere integrati con l'imaging confocale del gel contraente in 3D per caratterizzare la dinamica di contrazione in entrambe le direzioni laterale e verticale. La microscopia confocale viene utilizzata per misurare la spaziatura tra i due vetrini di copertura: questa distanza definisce lo spessore iniziale del gel. Inoltre, lo spessore del gel deve essere misurato alla fine dell'esperimento quando viene raggiunto uno stato meccanicamente stabile.
Diversi criteri devono essere soddisfatti per dimostrare che le reti di actomiosina si comportano come un materiale poroelastico: (i) la rete non si rimodella, il che dedurrebbe che si comporta come un materiale elastico (Figura 4), (ii) il flusso di acqua (solvente) attraverso i pori del gel è guidato dalla contrattilità della miosina (Figura 5) e (iii) il rilassamento dello stress elastico è caratterizzato da un'efficace costante di diffusione, D ~ κ/γ, che dipende dal modulo elastico efficace del gel, κ, e dalla costante di attrito effettivo, γ, che spiega l'attrito tra il solvente in movimento e i pori del gel (Figura 6). Di seguito, discutiamo ciascun criterio separatamente e dimostriamo come sono soddisfatti nel sistema attuale.
Obiettivo (i)
In primo luogo, la struttura e la porosità del gel dovrebbero essere analizzate e dovrebbe essere determinato se la rete si sta rimodellando dinamicamente. Una rappresentazione schematica della rete di actomiosina è illustrata nella Figura 4A. La formazione della rete inizia con la nucleazione spontanea e la polimerizzazione dei filamenti di actina, che successivamente si raggruppano (Figura 4B). La rete quindi si auto-organizza attivamente in una rete interconnessa macroscopicamente isotropa di fasci di actina, che diventa dinamicamente grossolana con il tempo e alla fine si contrae. L'auto-organizzazione e la contrazione della rete sono guidate dagli aggregati di miosina, che si localizzano prevalentemente nei punti di intersezione dei fasci di filamenti (Figura 4C). Gli aggregati di miosina rimangono attaccati alla rete attraverso la contrazione del gel, da cui si può concludere che questi gel di actomiosina si comportano come materiali attivi elastici (Figura 4C). Inoltre, in questi gel di actomiosina, la contrazione è governata dallo scorrimento del filamento, come dedotto confrontando le distanze end-to-end dei fasci di filamenti, l end-to-end e le lunghezze del contorno, lcont (Figura 4D,E). Ciò contrasta con la contrazione dei fasci di actina sciolti reticolati dalla α-actina, che sono dominati dalla deformazione del filamento di actina29.
La porosità del gel è caratterizzata dalla dimensione dei pori del gel attraverso i quali si muove il flusso del solvente. Per le reti di actina purificate, la dimensione della maglia, che definisce la distanza tra i legami incrociati nel gel (qui, gli aggregati di miosina), fornisce una buona stima anche della dimensione dei pori del gel. La dimensione della mesh può essere estratta direttamente dalle immagini di fluorescenza (2D) e viene valutata dalla media geometrica delle distanze tra coppie di fasci di actina opposti in un poro di gel (Figura 4B). Poiché la rete è isotropa fino all'inizio della contrazione, le dimensioni medie delle maglie nelle direzioni verticale (cioè attraverso lo spessore) e laterale (lungo il raggio) sono le stesse, ξ 0, = ξ 0,ll
= ξ0 (= 67 μm ). Poiché i fasci di actina rimangono dritti durante la contrazione, le dimensioni della maglia e dei pori si restringono in proporzione alle variazioni dello spessore e del diametro del gel. Per l'attuale sistema sperimentale, la contrazione nel piano (radiale) inizia dopo la fine della contrazione verticale (non mostrata), in modo tale che la contrazione radiale proceda ad uno spessore costante del gel inferiore allo spessore iniziale di un fattore di ~ 0,3. Di conseguenza, mentre la dimensione della maglia all'interno del piano di contrazione, ξ ll (t) = r(t)/R, diminuisce durante la contrazione radiale, dove r(t) è il raggio del gel al tempo t, la dimensione media della maglia nella direzione perpendicolare è costante, ξ
= 20μm23. Questi valori delle dimensioni delle maglie/pori sono utilizzati per valutare il modulo elastico del gel, κ, e il coefficiente di attrito, γ, come dettagliato di seguito (Obiettivo [iii], Figura 6).
Obiettivo (ii)
Questo scopo consiste nel dimostrare che un flusso di solvente verso l'esterno è generato dalla contrattilità della miosina. Per tracciare il flusso di solvente, le sfere fluorescenti vengono aggiunte alla soluzione di actomiosina. Le perle sono passivate per ridurre l'interazione tra le perle in movimento e la rete di actomiosina. Complessivamente, 1 μL di perline (Tabella dei materiali) viene incubato con 5 μm di G-actina per 20 minuti a temperatura ambiente e l'eccesso di G-actina viene rimosso mediante centrifugazione (Tabella dei materiali, vedere la sezione protocollo per i dettagli). Questo passaggio viene ripetuto con 10 mg·mL-1 BSA (Tabella dei materiali). Le perle vengono aggiunte alla soluzione proteica ad una diluizione finale di 1:10.000 v/v. Poiché l'obiettivo è quello di consentire alle perle di muoversi liberamente attraverso il poro del gel, è importante adattare i diametri delle perle alla dimensione dei pori del gel, in modo tale che il loro rapporto di dimensione sia sempre <<1. Pertanto, le sfere di diametro 2.300 nm vengono utilizzate per analizzare le fasi iniziali e intermedie della contrazione (Figura 5A,B) quando la dimensione media dei pori è maggiore di 15 μm e le perle di diametro 200 nm vengono utilizzate quando la dimensione dei pori è più piccola (Figura 5D-G). La posizione del centro di massa delle perle viene estratta per ogni volta, t, (x(t),y(t))bead, utilizzando un algoritmo standard di tracciamento delle particelle (Table of Materials), da cui è possibile dedurre la traiettoria (Figura 5B) e la velocità locale del tallone, 
. Le perle, e quindi il solvente penetrante, si muovono in media nella direzione radiale verso l'esterno (Figura 5A,B), mentre il gel si contrae verso l'interno, come mostrato dall'analisi della velocimetria ad immagine di particelle (PIV) (vedere le frecce verdi in Figura 6A). Questo moto radiale può essere ulteriormente elaborato estraendo la velocità radiale delle sfere locali, νr, che viene valutata proiettando la velocità del tallone locale sulla direzione radiale definita dal vettore unitario, , collegando il centro del gel (x 0, 
y0) e la posizione del centro di massa del tallone al tempo t: 
dove
I dati mostrano che quando le perle si spostano verso l'esterno dal centro del gel, le loro velocità inizialmente aumentano e poi rallentano man mano che si avvicinano al confine del gel (Figura 5C). In particolare, la velocità del tallone può essere 20 volte maggiore della velocità di contrazione radiale del gel (curva blu nella Figura 5C). I cerchi pieni segnano il momento in cui le perline lasciano il gel. Le perle continuano a muoversi dopo essere uscite dal confine del gel per qualche tempo. Questo movimento non può derivare da effetti inerziali, poiché il numero di Reynold è <10-4. La velocità radiale del tallone diminuisce con il tempo concomitante alla diminuzione della contrazione del gel; In particolare, quando la velocità di contrazione radiale del gel è diminuita significativamente, la velocità delle perle fluttua in modo significativo.
Per verificare se queste fluttuazioni derivano dalla struttura porosa dell'attomiosina, la rete traccia il movimento delle perle a una risoluzione spaziale più elevata, che è possibile quando la contrazione del gel è significativamente rallentata (Figura 5D-F). La traiettoria delle perle è infatti tortuosa (Figura 5D,E), con fluttuazioni significative nella velocità locale delle perle, che riflette la struttura porosa del gel, cioè la velocità locale è più veloce vicino al centro dei pori e più lenta in prossimità di un fascio di actina (Figura 5F).
Infine, il calcolo della funzione di correlazione velocità gel/velocità solvente dimostra che localmente il flusso del fluido è diretto in senso opposto al gel contraente. Usando punti luminosi locali nel gel come marcatori fiduciali, la loro posizione del centro di massa per ogni punto temporale, t, (x(t),y(t))gel, può essere calcolata, e la velocità locale del gel può essere derivata: 
. Quindi, per ogni perlina e un punto vicino nel gel, viene calcolata la correlazione locale velocità perla-velocità gel per estrarre l'angolo, θ, tra i due vettori: 
, dove 
e sono le velocità locali (grandezza) della perlina e 
del gel, rispettivamente. I dati mostrano che indipendentemente dalla posizione del tallone all'interno del poro del gel, localmente, il flusso del fluido è diretto nella direzione opposta rispetto al gel (Figura 5G). Nel complesso, i risultati mostrano che un flusso di fluido verso l'esterno è generato dalla contrattilità della miosina, come previsto per un materiale attivo poroelastico 3,7,23,30.
Obiettivo (iii)
Questo scopo consiste nel dimostrare che il rilassamento dello stress è caratterizzato da un'efficace costante di diffusione poroelastica, D, che dipende dal modulo elastico della rete, dalla porosità e dalla viscosità del solvente. In primo luogo, viene quantificata la velocità laterale (nel piano) del gel in contrazione (Figura 6A). In primo luogo, le immagini di fluorescenza vengono binarizzate e viene estratta l'area proiettata dal gel in ogni punto temporale t, A(t). Quindi, viene calcolato 
il raggio del gel (Figura 6B). Da questo, viene derivata la velocità di contrazione radiale nel punto temporale t,,
che descrive la velocità del bordo del gel (Figura 6C). La velocità del bordo mostra un tipico profilo di evoluzione temporale caratterizzato da una fase lineare iniziale, in cui la velocità del bordo aumenta ad una velocità costante, , fino a raggiungere una velocità massima, ν max, 
al tempo t max. La velocità decade quindi esponenzialmente con un tempo di rilassamento caratteristico, τ, fino a raggiungere uno stato meccanicamente stabile (Figura 6C). L'rmaxè il raggio del gel all'inizio di quella fase di rilassamento.
Per un materiale poroelastico, il tempo 
di rilassamento , dove 
è una costante di diffusione poroelastica efficace, κ è un modulo gel elastico efficace e γ è una costante di attrito efficace che spiega il movimento della soluzione acquosa attraverso i pori del gel di actina. Il modulo elastico ha unità di energia per unità di volume ed è inversamente proporzionale al volume di un'unità di cella nel gel, determinato dalla distanza tra i legami incrociati o dalla dimensione della maglia, tale che 
. Il coefficiente di attrito, γ, dipende dalla faccetta dei pori perpendicolare al flusso di solvente. Per la contrazione del gel nel piano, la faccetta dei pori rilevante è , e, di conseguenza, il coefficiente 
di attrito , dove η è 
la viscosità del solvente31,32. Nel complesso, otteniamo la seguente relazione: 
, dove la dimensione 
dei pori nel piano rilevante viene valutata a tmax. Complessivamente, otteniamo 
, che deduce che il tempo di rilassamento dovrebbe scalare linearmente con la viscosità del solvente23.
Per verificare se questa relazione viene rispettata, gli esperimenti vengono ripetuti con diverse quantità di glicerolo. L'uso del glicerolo è vantaggioso in quanto non si prevede che influenzi l'attività delle proteine, in particolare i motori della miosina. Inoltre, sono disponibili in letteratura correlazioni tra la viscosità delle soluzioni acquosa-glicerolo e la quantità di glicerolo aggiunto28. Queste correlazioni mostrano che un aumento della percentuale di peso del glicerolo dallo 0% al 34% porta ad un aumento proporzionale della viscosità della soluzione acqua-glicerolo da η ω a 2,76 η ω, dove η ωè la viscosità dell'acqua a 20 °C. In questo intervallo di glicerolo e per lo stesso diametro iniziale di caduta, 2R = 2.800 μm, un aumento della viscosità aumenta la durata delle fasi di polimerizzazione della rete e di auto-organizzazione, sebbene l'accelerazione lineare e la velocità massima di contrazione radiale (νmax) siano grossolanamente invariate. Questa evidenza suggerisce che sia la riorganizzazione della rete (porosità) che l'attività della miosina non sono influenzate dalla viscosità della soluzione23, e l'effetto della viscosità del solvente dovrebbe riflettersi essenzialmente nel tempo necessario affinché le sollecitazioni elastiche si rilassino. Infatti, il tempo di rilassamento mostra una dipendenza lineare dalla viscosità della soluzione (Figura 6D), che deduce che la relazione di scala derivata sopra è rispettata, confermando ulteriormente la natura poroelastica del sistema.
Figura 1: Descrizione schematica delle tre fasi principali della procedura di trattamento superficiale del vetrino. (i) pulizia della superficie del vetro (trattamento Piranha) e idrofilizzazione, (ii) silanizzazione superficiale e (iii) passivazione con mPEG-mal. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Passivazione del vetrino di copertura. (A) La pulizia e la silanizzazione dei piranha vengono eseguite in un becher da 400 ml utilizzando un supporto in politetrafluoroetilene fatto in casa costituito da 12 scanalature lineari. (B) La passivazione superficiale viene eseguita in una capsula di Petri rivestita di parafilm. Ogni foglietto viene incubato con 1 mL di 5 kDa mPEG-mal a 4mg·mL−1 in 1x PBS (Table of Materials) per 1 ora a 22 °C. Lo strato di parafilm idrofobo assicura che la soluzione polimerica di PEG idrofilo rimanga confinata sulla superficie del vetro per tutto il tempo di incubazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Esecuzione di un esperimento: il portacampioni fatto in casa. Gli esperimenti vengono eseguiti in un portacampioni fatto in casa che si adatta alle dimensioni di uno stadio di microscopio standard. (A) Un distanziatore di parafilm ingrassato di spessore h (~150 μm) viene posto su un vetrino di copertura passivato tramite PEG e tale foglietto viene inserito nel portacampioni. B) la soluzione di actomiosina è preparata su ghiaccio in una provetta di Eppendorf e 1,1 μL di tale soluzione sono poste sul vetrino; quindi (C) un secondo coprislip passivato PEG viene posizionato sopra di esso, e (D) il portacampioni viene avvitato per limitare la goccia, che adotta una forma simile a un disco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Obiettivo di poroelasticità (i). La rete di actomiosina si comporta come un materiale elastico. (A) Rappresentazione schematica di una rete di actomiosina. (B) Formazione della rete di actiomiosina. Le immagini al microscopio a fluorescenza dimostrano che i filamenti di actina si nucleano spontaneamente e polimerizzano in una rete isotropa interconnessa che diventa grossolana con il tempo e alla fine si contrae macroscopicamente. La porosità della rete è caratterizzata dalla dimensione della maglia della rete, ξ (doppia freccia). (C-E) La contrazione della rete di actiomiosina è guidata dallo scorrimento del fascio di filamenti di actina. (C) La contrazione della rete inizia alla periferia del gel ("P") e si propaga verso l'interno nella massa del gel. Le frecce bianche mostrano la direzione di contrazione. Il centro del gel è contrassegnato da una "C". Le immagini fluorescenti mostrano che gli aggregati motori della miosina (561 nm, punti rossi) sono incorporati nella rete di actina (488 nm, verde) e rimangono attaccati ad essa per tutta la contrazione della rete. (D) I fasci di filamenti di actina rimangono dritti durante la contrazione della rete. Il rapporto tra la lunghezza del contorno, l cont, e la distanza end-to-end, lend-to-end, in funzione del tempo. (E) Distribuzione del rapporto tra la lunghezza del contorno e la distanza da un capo all'altro a t = 316 s (rosso fisso) e t = 327 s (striato, grigio). Riquadro: lunghezza del contorno (blu) e distanza end-to-end (bianco) di un tipico fascio. Condizioni: (B,C,E[riquadro]): Le immagini vengono acquisite su un microscopio fluorescente invertito con una camera EMCCD e un obiettivo aereo UPlanFL 10x/0.3 Ph1 in modalità normale (B) e in modalità dual imaging dopo sovrapposizione di immagini (C,E[riquadro]). Le barre della scala sono (B,C) 100 μm e (E[riquadro]) 50 μm. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Ideses et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Obiettivo di poroelasticità (ii). Un flusso di solvente verso l'esterno è generato dalla contrattilità motoria della miosina. (A) Imaging del gel a basso ingrandimento negli stadi intermedi di contrazione: imaging simultaneo a fluorescenza di una rete di actina contraente (488 nm, a sinistra) e sfere fluorescenti da 2.300 nm aggiunte alla soluzione (561 nm, a destra) in funzione del tempo. I cerchi segnano le posizioni di quattro perline. Le frecce segnano la direzione globale del movimento delle perline. (B) Sono rappresentate le traiettorie di nove perle selezionate. Le frecce segnano la direzione radiale globale del movimento delle perline. La croce cerchiata indica il centro del gel (x0,y0) (C) Velocità radiale locale del tallone νr (cerchi aperti) e velocità del bordo del gel (radiale) (punti blu) rispetto al tempo. I cerchi riempiti indicano il momento in cui una determinata perla esce dal bordo del gel. (D-F) Risolvere la porosità della rete e il movimento del solvente attraverso i pori del gel negli stadi avanzati di contrazione. (D) Immagini di epifluorescenza del gel contraente e sfere fluorescenti del diametro di 200 nm aggiunte alla soluzione. Sia l'actina che le perline sono eccitate a 488 nm. I cerchi rossi seguono la posizione di una perlina con il tempo. La linea grigia indica il confine del gel. (E) Traiettoria del tallone mostrata in (D). Nel campo mostrato, il gel si contrae in media verso il basso. Le coordinate vengono misurate in relazione all'origine della telecamera. (F) La velocità locale del tallone riflette la struttura porosa del gel. In alto: velocità locale del tallone (cerchi aperti), velocità del gel locale (cerchi grigi) e velocità del bordo del gel (cerchi blu) rispetto al tempo. In basso: le istantanee mostrano la posizione del tallone per i tempi selezionati. La perlina è contrassegnata da un cerchio rosso. La linea tratteggiata segna il momento in cui il tallone esce dal gel. (G) Distribuzione degli angoli tra il gel locale e le velocità delle sfere locali. Condizioni: Le immagini vengono acquisite su un microscopio fluorescente invertito con una camera EMCCD e (A) un obiettivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075 e (D,F) un obiettivo UPlanFL 10x/0.3 Ph1. Le barre della scala sono (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) e 50 μm. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Ideses et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Obiettivo di poroelasticità (iii). Il rilassamento da sforzo è caratterizzato da un'efficace costante di diffusione poroelastica. (A) Immagini di fluorescenza dall'alto di un gel di actomiosina in contrazione a basso ingrandimento dal tempo di miscelazione fino allo stato stazionario. Il campo di velocità (frecce verdi) viene estratto dall'analisi PIV. Le immagini vengono acquisite su un microscopio fluorescente invertito con una camera EMCCD e un obiettivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075. La lunghezza d'onda di eccitazione è di 488 nm (actina). La barra della scala è di 500 μm. (B) Raggio del gel e (C) velocità di contrazione radiale, (cioè la velocità del bordo del gel rispetto al tempo). A denota l'accelerazione, 
VMax denota la velocità massima e τ è un tempo di rilassamento caratteristico. (D) Le reti di attomiosina si comportano come un materiale attivo poroelastico. 
e viscosità del solvente, η, rispetto alla percentuale di peso del glicerolo (wt%). Le quantità sono normalizzate ai loro valori allo 0% in peso di glicerolo. Il raggio iniziale del gel è R = 1.400 μm. Le barre di errore sono le deviazioni standard dei valori sperimentali. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Ideses et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Qui, un approccio in vitro è impiegato per caratterizzare la meccanica dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello del citoscheletro cellulare e, più in generale, del citoplasma cellulare, che ha dimostrato di comportarsi come un materiale poroelastico 3,5. La reologia del citoscheletro cellulare (citoplasma) è stata caratterizzata da una costante di diffusione poroelastica, che determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracellulare a ridistribuirsi all'interno della cellula dopo l'applicazione di stress meccanico. Le cellule sono state proposte per utilizzare questo meccanismo per regolare la loro forma5.
Motivati da questi risultati, abbiamo sviluppato un quadro per studiare la poroelasticità in vitro. Utilizzando il sistema modello proposto, forniamo approfondimenti su come la contrattilità della miosina contribuisce all'emergere di un flusso di fluido e su come la velocità della rete e la direzionalità e la velocità del solvente siano correlate nel tempo e nello spazio. Attraverso questo, dimostriamo che la rete e il solvente incorporato sono interconnessi e non possono essere considerati oggetti separati. Descriviamo la configurazione sperimentale e forniamo un protocollo dettagliato per preparare i gel ed eseguire un esperimento. Viene inoltre presentato un quadro dettagliato per la quantificazione dei dati. Il quadro proposto può essere facilmente adattato per studiare la poroelasticità in una varietà di configurazioni e sistemi sperimentali, indipendentemente dalla specificità del sistema sperimentale studiato.
Convalidiamo la poroelasticità delle reti di actomiosina analizzando i cambiamenti nella scala temporale del rilassamento dello stress. Scegliamo di dimostrarlo variando la viscosità del mezzo aggiungendo varie quantità di glicerolo alla soluzione di actomiosina. Il vantaggio dell'utilizzo del glicerolo è che non influisce sulla porosità e sulla struttura delle reti e, quindi, l'unico effetto sul rilassamento dello stress è l'aumento dell'attrito tra la soluzione in movimento e i pori del gel23. I cambiamenti nella porosità della rete avrebbero generato un'ulteriore complicazione, poiché sia il modulo elastico che la dimensione dei pori della rete influenzano il tempo di rilassamento in modo non lineare 23,31,32.
L'esecuzione di esperimenti di successo richiede la passivazione dei vetrini di vetro con un polimero inerte. Questo passaggio è cruciale. Il procedimento utilizzato per la passivazione del vetro può essere sostituito con altri procedimenti se la qualità della passivazione è preservata33,34. La passivazione superficiale difettosa può dare origine a una massiccia adesione proteica, che può inibire l'assemblaggio della rete. La passivazione del vetro è anche importante per prevenire l'interazione del gel di contrazione con le superfici di vetro. Ciò porterebbe a un ulteriore termine di attrito, oltre all'attrito fluido-gel considerato qui, che sarebbe molto più difficile da stimare o quantificare. Oltre alla passivazione superficiale, esperimenti di successo richiedono l'uso di actina fresca. Inoltre, anche l'attività dei motori è cruciale e la preparazione di nuovi lotti di miosina deve essere ripetuta ogni 3-4 mesi.
Nel complesso, questo approccio sperimentale ha dimostrato di avere successo per lo studio della poroelasticità in vitro. Una limitazione della procedura sperimentale attualmente impiegata è come controllare le dimensioni iniziali del gel in modo più robusto. Un'opzione potrebbe essere quella di utilizzare camere preformate di dimensioni controllabili. L'uso di camere preformate consentirebbe inoltre non solo al ricercatore di controllare meglio le dimensioni del sistema, ma anche di modificare facilmente la geometria del sistema.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Dina Aranovich per la purificazione e l'etichettatura delle proteine. G.L. è grato al Ministero israeliano della Scienza, della Tecnologia e dello Spazio per la borsa di studio Jabotinsky PhD. A.B.G. è grata alla Israel Science Foundation (sovvenzione 2101/20) e al Ministero della Scienza e della Tecnologia - Stato di Israele (sovvenzione 3-17491) per il sostegno finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
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